Использование тепловой индукции для экспрессии цветочных генов с помощью CRISPR
Распространение растений и перенос генов от генетически модифицированных или инвазивных видов к диким родственникам — серьёзная проблема для общества и регуляторных органов. Для противодействия этому разрабатываются стратегии — от поиска естественно стерильных растений до создания стерильности с помощью генного редактирования.
С развитием молекулярной биологии цветения появились методы, нацеленные на консервативные цветочные гены для генетической изоляции, такие как РНК-интерференция и технология CRISPR.
Попытки индуцировать раннее цветение у деревьев включали манипуляции с фотопериодом и гормональные обработки, а генетическое ускорение цветения в основном базировалось на стабильной трансформации. Однако эти методы сталкивались с проблемами: различной реакцией у разных клонов и непреднамеренным влиянием на форму растения.
Ключевая задача — эффективно контролировать генетический поток, не оказывая негативного влияния на общую форму цветка и вегетативные структуры нормально цветущих деревьев.
В июне 2023 года журнал Horticulture Research опубликовал исследование "Variation in floral form of CRISPR knock-outs of the poplar homologs of LEAFY and AGAMOUS after FT heat-induced early flowering".
Исследование было сосредоточено на оптимизации ранней индукции цветения у клонов тополя 717 (Populus tremula x Populus alba) и 353 (Populus tremula x Populus tremuloides). Используя четыре разные конструкции с комбинациями промоторов и генов (HSP:AtFT, 35S:PtFT1, 409S:AtFT, 35S:AtFT), учёные стремились вызвать раннее цветение у отобранных клонов.
Результаты показали, что конструкция HSP:AtFT дала самый высокий процент цветения у обоих клонов (717 и 353), при этом женский клон 717 показал более низкую частоту цветения, чем мужской клон 353.
Далее исследование индуцировало раннее цветение у отобранных CRISPR-деревьев из обоих клонов, используя либо конститутивные, либо термоиндуцибельные цветочные конструкции. Были отобраны растения с биаллельными мутациями в гене LFY или биаллельными изменениями в обоих генах AG из мужского клона 353 и женского клона 717. Эти растения затем подвергли двум экспериментальным подходам: один с использованием конститутивного промотора 35S для экспрессии AtFT, другой — с термоиндуцибельной цветочной конструкцией HSP:AtFT.
Первый подход, применённый к мужскому клону 353, показал, что в контрольных деревьях дикого типа цветения не происходило, а ретрансформация некоторых событий LFY (DL106) дала частоту цветения до 83,3%. Второй подход включал ретрансформацию отобранных событий в обоих клонах с использованием термоиндуцибельной конструкции HSP:AtFT.
Для клона 353 зацвело 22,4% всех деревьев, а для клона 717 — 34,1%. Примечательно, что, несмотря на индукцию цветения, вегетативная производительность (измеряемая высотой дерева) оставалась одинаковой у цветущих и нецветущих деревьев в обоих клонах. Кроме того, в то время как мужской клон 353 в целом выглядел здоровым после тепловой индукции, женский клон 717 проявлял некоторые признаки стресса, такие как пожелтение нижней листвы.
Что касается морфологии цветков, то в то время как контрольные деревья HSP:AtFT обычно производили стандартную терминальную серёжку, события ретрансформации приводили к появлению различных атипичных серёжек и цветочных структур. В частности, деревья с нокаутом гена AG демонстрировали разнообразные реплицированные цветочные органы, внешний вид которых сильно варьировался по размеру и цвету.
В заключение, это исследование успешно применило тепловую индукцию сверхэкспрессии гена FT для ускоренной оценки фенотипов цветков после CRISPR-нокаута ключевых цветочных генов LEAFY и AGAMOUS у тополей. Модифицированные тополя продемонстрировали широкий спектр форм соцветий и цветков.
Эти результаты не только подчёркивают потенциальную садоводческую ценность таких модификаций, но и дают раннее представление о влиянии нокаута конкретных генов на характеристики цветка и явную стерильность, прокладывая путь для потенциального применения в контроле селекции растений и смягчении проблем переноса генов.