Использование CRISPR для дозозависимой активации экспрессии генов
Исследователи из нескольких учреждений США разработали метод дозозависимой активации экспрессии генов с помощью техники редактирования генов CRISPR. Их работа опубликована в журнале Nature Biotechnology.
Предыдущие исследования показали, что CRISPR/Cas9 можно использовать для подавления или активации экспрессии генов, но не для её дозозависимой активации. В новой работе эта задача решена с помощью химических эпигенетических модификаторов (CEMs), специально разработанных для активации нужной экспрессии генов с использованием частей эндогенной хроматин-активирующей системы. Это устранило необходимость в экзогенных транскрипционных активаторах.
Новый подход включал два компонента:
- Каталитически неактивный Cas9 вместе с белком связывания FKBP.
- CEM на основе FK506, связанный с молекулой, взаимодействующей с желаемой клеточной эпигенетической системой.
Были созданы CEM-активирующие молекулы (CEM114, CEM87 и CEM88), предназначенные для связывания с различными целевыми ферментами. Вместе эти две части использовались для активации экспрессии генов заданным образом.
Систему протестировали на клетках HEK293T, инфицированных геном флуоресцентного зелёного белка (GFP). После экспрессии направляющей РНК и неактивного Cas9 в клетках провели цитометрию. Активацию гена тестировали с помощью плазмидной экспрессии вместе с одним из трёх выбранных CEMs.
Через два дня подтвердили, что экспрессия GFP увеличилась по сравнению с необработанными клетками. Анализ показал, что именно системы CEM активировали GFP желаемым образом. При этом только обработка CEM87 привела к увеличению экспрессии GFP.
Исследователи полагают, что их метод может применяться в валидационных исследованиях, требующих дозозависимой активации экспрессии генов.