Программное обеспечение для предсказания эффективности направляющих РНК для CRISPR-Cas9
Система CRISPR-Cas9 позволяет с высокой точностью редактировать геномы, что открывает перспективы для улучшения здоровья человека и состояния окружающей среды. Белок Cas9, подобно молекулярным ножницам, разрезает ДНК в заданном месте, которое определяется направляющей РНК (guide RNA). Однако для одного гена-мишени может существовать несколько возможных направляющих РНК, и выбор наиболее эффективной из них часто требует трудоёмкого перебора.
Чтобы исключить этот процесс методом проб и ошибок, команда под руководством Джорджа Чёрча из Гарвардской медицинской школы разработала новое программное обеспечение для предсказания лучших направляющих РНК.
Разработка алгоритма на основе экспериментальных данных
В отличие от других доступных алгоритмов, работающих только на теоретических принципах, новое ПО ранжирует эффективность направляющих РНК на основе экспериментальных данных, собранных на человеческих геномах.
Для создания алгоритма команда провела высокопроизводительный анализ взаимодействия множества генов-мишеней и комплементарных направляющих РНК, чтобы найти закономерности в последовательностях РНК, указывающие на эффективность связывания.
Экспериментальный подход:
- Для каждого гена-мишени выбрали уникальную последовательность и синтезировали идентичную цепь ДНК.
- Создали обширную библиотеку ДНК, размещённую в плазмидах клеток.
- Доставили библиотеку в геномы культивируемых клеток с помощью вирусного вектора.
- Внесли в клетки Cas9 с набором направляющих РНК.
- С помощью экстракции и секвенирования генома определили, какие направляющие РНК наиболее успешно нашли свою мишень и привели к мутациям.
На основе этих данных был разработан алгоритм, который присваивает оценку эффективности любой направляющей РНК, даже для генов, отсутствующих в экспериментальной базе данных.
Публичная доступность и применение
Программное обеспечение находится в открытом доступе. Оно содержит информацию об эффективных направляющих РНК не только для наиболее часто используемого Cas9 из S. pyogenes, но и самую полную в мире библиотеку для набирающего популярность Cas9 из S. thermophilus.
Этот инструмент позволит значительно ускорить и повысить точность выбора оптимальной направляющей РНК. Учёные смогут сфокусироваться на применении CRISPR-Cas9 для разработки генной терапии таких заболеваний, как серповидноклеточная анемия, рак или ВИЧ, а также для создания генетически модифицированных организмов, способных, например, очищать окружающую среду.