Простой способ извлечения небольших геномов из смеси различных организмов

Ученые из Института зоологии и исследований дикой природы имени Лейбница (IZW) под руководством Алекса Гринвуда представили в журнале PLOS ONE простой способ извлечения небольших геномов из смеси ДНК различных организмов.

Молекулярный анализ образцов тканей всегда ставит перед учеными проблему: как выделить геном конкретного патогена из смеси ДНК пациента и его микробных "сожителей"? "Очень просто", — говорит Алекс Гринвуд. Короткая одноцепочечная последовательность оснований используется как "приманка" для подготовленной смеси ДНК. К комплементарной целевой последовательности "приманки" со временем присоединяются многие другие соседние фрагменты.

Для этого не требуется новый метод. Все необходимое предоставляет так называемый метод гибридизационной ловушки (hybridisation capture). Важно лишь внимательно проанализировать полученные данные.

Дополнительную ценность этого метода случайно обнаружил аспирант Гринвуда Кириакос Цангарас. Технология использует магнитные шарики с прикрепленными короткими "приманками" — олигонуклеотидами (олиго) в несколько пар оснований. При добавлении в смесь одноцепочечных фрагментов ДНК к олиго привязываются только комплементарные целевые последовательности, образуя короткие двуцепочечные фрагменты. Шарики извлекаются магнитом, несвязанные фрагменты смываются, а затем целевые фрагменты элюируются с шариков и секвенируются.

Цангарас хотел сравнить конкретную последовательность митохондриальной ДНК у разных грызунов Юго-Восточной Азии, используя "приманку" длиной около тысячи пар оснований. В результате был получен не только целевой фрагмент, но и полный митохондриальный геном грызунов из общей "ДНК-смеси".

Контрольные эксперименты подтвердили результат. Совместно с Томом Гилбертом из Центра геогенетики в Копенгагене ученые пришли к самому очевидному объяснению — должна была произойти цепная реакция.

Образец до обработки содержал интактную двойную спираль, которая затем была фрагментирована. Одноцепочечная ДНК способна спонтанно связываться с любой подходящей комплементарной цепью. После того как комплементарный фрагмент цепи A связался с "приманкой", соседний фрагмент цепи B связался с его выступающим концом. Затем присоединился следующий фрагмент цепи A, потом снова B и так далее.

Этот процесс, при котором один фрагмент ДНК "захватывает" перекрывающиеся фланкирующие последовательности, авторы назвали "CapFlank". Таким образом, с помощью крошечного фрагмента можно получить обширную генетическую информацию. В тестах эффективности принципа "побочного улова" были получены целые митохондриальные геномы и почти полная геномная последовательность бактерии.

CapFlank открывает новые возможности, например, в генетическом анализе патогенов. "Мы можем использовать короткие консервативные последовательности генов, чтобы получить геном (или по крайней мере его большие участки) патогенных вариантов вирусов гриппа или совершенно новых патогенов", — объясняет Гринвуд. Следующая задача команды — выделить простые и хорошо охарактеризованные ДНК-вирусы, такие как герпесвирус слонов.

Метод CapFlank также применим к сильно фрагментированной "древней ДНК", извлеченной из костных образцов музейных коллекций, которые часто загрязнены микробной или человеческой ДНК. Коллеги Гринвуда успешно применили CapFlank к образцам коал из музеев.

Наиболее эффективен метод со свежей ДНК. Из кишечной бактерии Escherichia coli, содержащейся в образце человеческой мочи, ученые извлекли 90% генома за один подход.