Быстрая очистка и характеристика циркулирующих малых внеклеточных везикул на безындикаторном чипе
Все клетки естественным образом секретируют наноразмерные внеклеточные везикулы — частицы, ограниченные липидным бислоем. Это делает их валидными биомаркерами для выявления различных заболеваний.
Для изучения их потенциала в диагностике, прогнозе и терапии важно эффективно выделять малые внеклеточные везикулы, сохраняя их выход и чистоту.
Традиционные методы выделения имеют недостатки: низкую чистоту и выход, длительные процедуры экстракции, необходимость в специализированном оборудовании и высокую стоимость.
В исследовании, опубликованном в Scientific Reports, Манджу Шарма и команда ученых в области биомедицинской инженерии из Университета Цинциннати (Огайо, США) разработали новое устройство на основе изоляторной диэлектрофоретической технологии для быстрого выделения малых внеклеточных везикул из биожидкостей и среды культивирования клеток на основе их диэлектрических свойств.
Ученые охарактеризовали малые внеклеточные везикулы, выделенные из биожидкостей пациентов с онкологическими заболеваниями, с помощью этого прибора. Они провели трехэтапную характеристику с использованием традиционной проточной цитометрии, усовершенствованной проточной цитометрии с визуализацией и секвенирования микроРНК, чтобы получить высокий выход чистых внеклеточных везикул. Платформа эффективна для быстрого выделения биомаркеров и сохранения биомолекулярной целостности везикул.
Мембранные биологические сосуды
С биологической точки зрения, малые внеклеточные везикулы — это мембранные биологические сосуды, обнаруживаемые в биожидкостях (кровь, моча, слюна, семенная жидкость, грудное молоко, спинномозговая жидкость) и выделяемые клетками во внеклеточное пространство.
Такие наноразмерные везикулы могут горизонтально переносить свой биомолекулярный груз, функционируя как межклеточные сигнальные векторы. Внеклеточные везикулы обеспечивают высокую степень чувствительности и специфичности благодаря своей отличной стабильности. Их раннее обнаружение в жидких биопсиях может улучшить диагностику рака, инфекций, нейродегенеративных и метаболических заболеваний.
Однако выделение везикул является сложной задачей из-за их наноразмерности и физико-химических свойств. Методы выделения обычно зависят от свойств внеклеточных везикул. Хотя существующие устройства имеют перспективные атрибуты, их стоимость изготовления, необходимость разбавления образца и склонность к засорению остаются неотъемлемыми проблемами.
В ответ на это Шарма и коллеги разработали новый подход на основе изоляторной диэлектрофоретической технологии с микростолбиками в микрофлюидных каналах для быстрого захвата наночастиц на основе их размера и уникальных диэлектрических свойств.
Механизм действия
Устройство содержало массив микропипеток, способных выделять наночастицы из малых объемов образца путем приложения значительно низкого электрического поля по длине пипеток. Архитектура геометрии пор позволила выделять внеклеточные везикулы из малых объемов кондиционированной среды культивирования клеток и биожидкостей здоровых доноров.
В данной работе команда выделила биожидкости пациентов с онкологическими заболеваниями (сыворотка, плазма, моча) с последующей многопараметрической характеристикой с помощью проточной цитометрии и секвенирования микроРНК следующего поколения.
Команда очистила малые внеклеточные везикулы из сыворотки, плазмы и мочи в фосфатно-солевом буфере, используя изоляторный диэлектрофоретический подход. Для подтверждения наличия везикул использовалась просвечивающая электронная микроскопия. Также было проведено многопараметрическое исследование очищенных циркулирующих малых внеклеточных везикул с помощью проточной цитометрии.
После выделения везикулы были проанализированы с помощью традиционной проточной цитометрии. Исследователи дополнительно продемонстрировали возможности устройства, охарактеризовав выделенные образцы с помощью программного обеспечения ImageStream.
После секвенирования микроРНК команда картировала 137 различных зрелых транскриптов микроРНК к геному человека в различных образцах, что позволяет включить устройство в рабочие процессы анализа микроРНК-биомаркеров. Были получены транскриптомные профили и проведен анализ главных компонент.
Перспективы
Таким образом, Манджу Шарма и коллеги продемонстрировали возможности и эффективность низковольтного безындикаторного устройства на основе изоляторной диэлектрофоретической технологии для выделения малых внеклеточных везикул из сыворотки, плазмы и мочи пациентов с онкологическими заболеваниями. Это было подтверждено детекцией субмикронных частиц и многопараметрической характеристикой с использованием как традиционной, так и усовершенствованной проточной цитометрии.
Концентрации РНК в этой работе были сопоставимы с результатами предыдущих исследований, что подтвердило жизнеспособность данного метода выделения в качестве альтернативы уже устоявшимся лабораторным методам. Эти аналитические методы могут быть полезны в качестве платформ для жидкой биопсии с целью выделения малых внеклеточных везикул и разработки диагностических и мониторинговых платформ на их основе.