Метод SLENDR: Метка белков в развивающемся мозге с помощью редактирования генома

Команда доктора Рёхэя Ясуды разработала метод SLENDR (single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair), позволяющий точно модифицировать ДНК нейронов в живых образцах. С помощью этой техники исследователи смогли надежно пометить два разных белка разными цветами одновременно в одной клетке.

Проблема и решение

Изучение изменений в клетках мозга при обучении и формировании памяти было ограничено из-за отсутствия методов визуализации отдельных белков внутри нейрона с достаточной специфичностью и разрешением. Существующие методы создания моделей были трудоемкими и дорогими.

Идея нового метода возникла после знакомства с системой редактирования ДНК CRISPR/Cas9. Эта система использует два пути репарации поврежденной ДНК:

• HDR (гомологичная рекомбинация) — точный путь, позволяющий вставить желаемый ген.
• NHEJ (негомологичное соединение концов) — менее точный путь, часто приводящий к «выключению» гена.

В зрелых, неделящихся клетках мозга преобладает путь NHEJ, что затрудняло точную вставку генов.

Суть метода SLENDR

Исследователи применили технику in utero electroporation для введения системы CRISPR/Cas9 в пренатальные клетки мозга, которые все еще делятся. В таких клетках поврежденная ДНК репарируется с помощью HDR. Это позволило добавить ген, делающий целевой белок видимым под микроскопом, и даже одновременно пометить два белка разными цветами. Точность вставки генов подтверждена методами визуализации и секвенирования ДНК.

Научное открытие

При тестировании метода было обнаружено новое поведение альфа-изоформы протеинкиназы C (PKCα). Через ~7 дней после рождения она была сконцентрирована у мембраны клетки (указывая на высокую активность), а через месяц — диффузно распределена по клетке (что говорит о снижении активности в более позднем развитии).

Значение

Как заявил Рёхэй Ясуда: «Я считаю, что SLENDR станет стандартным инструментом молекулярной и клеточной нейробиологии. Он предоставляет ценный способ определить субклеточную локализацию белков и поможет исследователям определить их функцию».