Выделение отдельной бактерии из толпы

Бактерии почти вездесущи и оказывают огромное влияние на здоровье человека и экосистем. Однако они во многом остаются для нас загадкой. Профессора Принстонского университета Земер Гитай, Бритт Адамсон и Нед Вингрин начали совместную работу по созданию новых инструментов для лучшего понимания бактерий. Их исследование описано в статье, опубликованной в журнале Nature Microbiology.

Бактерии невероятно многочисленны и поразительно разнообразны. В человеческом кишечнике содержится столько же бактериальных клеток, сколько человеческих клеток во всем теле, распределенных между примерно 500–1000 видами бактерий.

Отдельные бактерии одного вида могут выглядеть схоже, но демонстрировать разную реакцию на стресс в зависимости от паттерна экспрессии их генов — то есть от того, какие гены активно используются для производства конечных продуктов, таких как белки.

Исторически такую вариабельность между клетками было трудно уловить, потому что инструменты для изучения бактерий позволяли делать лишь обобщения о популяционных тенденциях в экспрессии генов. Это скрывало различия, которые могли объяснить важное поведение, например, развитие устойчивости к антибиотикам.

Недавно ученые начали использовать методы нового поколения, такие как single-cell RNA sequencing, позволяющие изучать экспрессию генов в сотнях тысяч отдельных клеток одновременно. Однако остаются проблемы: одни подходы ограничены изучением лишь узкого набора известных генов, а другие страдают от технических проблем, снижающих их чувствительность.

Команда Принстона во главе с аспирантом Брюсом Ваном решила преодолеть эти ограничения. Чтобы увидеть, какие гены экспрессируются в клетке, ученые ищут молекулы матричной РНК (mRNA), которые появляются при экспрессии гена, кодирующего белок. Проблема в том, что до 97% молекул РНК в бактерии — это другой тип РНК, рибосомальная РНК (rRNA).

Большинство методов работают, сначала помечая случайную выборку всех молекул РНК из клетки, а затем используя глубокое секвенирование для определения их идентичности. Более обильная rRNA секвенируется чаще, чем mRNA, что приводит к плохому соотношению сигнал/шум. Ван и его коллеги разработали способ удаления последовательностей рибосомальной РНК после этапа мечения, но до этапа секвенирования. Это обогащает образец mRNA и снижает стоимость секвенирования.

Ван также адаптировал метод на основе штрихкодирования (barcoding), чтобы этот подход можно было применять к сотням тысяч клеток одновременно.

Используя этот метод, группа исследовала фундаментальные вопросы бактериальной биологии. Например, они изучили, как бактерии E. coli реагируют на восемь различных типов антибиотиков.

Как и ожидалось, разные антибиотики вызывали разные ответы в зависимости от механизма их действия. Однако реакции отдельных клеток были чрезвычайно разнообразны: разные субпопуляции экспрессировали разные подмножества генов. Дальнейшее изучение этих генов может помочь в разработке более эффективных антибиотиков или их комбинаций.

Команда также исследовала реакцию бактерий на заражение вирусом бактериофагом λ. Неожиданно они обнаружили, что даже при соотношении фагов к бактериям 100:1 только треть бактерий фактически заражается и начинает производить его белки. Это показывает, как методы, изучающие реакцию популяции в целом, могут скрывать важные биологические сложности.

Новая технология, которую авторы называют M3-seq (massively parallel, multiplexed, microbial sequencing), не ограничивается изучением одного вида бактерий. Её можно использовать для исследования мультивидовых сообществ, таких как микробиом человека, открывая новые области для исследований.