Новый метод позволяет всесторонне анализировать внеклеточные взаимодействия мембранных белков

Белки в организме часто образуют комплексы, что определяет судьбу клеток. Поэтому анализ белок-белковых взаимодействий (PPI) критически важен для понимания биологической функции белков.

Мембранные белки, кодируемые более чем 30% генов человека, играют ключевую роль в функциях клеток. Многие из них функционируют в комплексах, что делает изучение PPI мембранных белков необходимым. Однако разработка технологий для анализа PPI, особенно внеклеточных белковых взаимодействий (exPPI) живых клеток, отставала.

Методы proximity labeling, которые маркируют близко расположенные белки для крупномасштабного анализа PPI, привлекают внимание. Однако существующие методы для внеклеточной области мембранных белков часто использовали молекулы с клеточной токсичностью, что требовало поиска систем для живых клеток.

Центр Proteo-Science Университета Эхиме самостоятельно разработал фермент proximity-dependent биотинилирования AirID, который биотинилирует остатки лизина близлежащих белков.

Были исследования с использованием подобных ферментов для анализа exPPI, но они включали генетически модифицированные белки с сильно измененной структурой, поэтому было неясно, насколько результаты отражают исходные взаимодействия.

Для точного понимания взаимодействий на мембране живых клеток необходимо было разработать технологию, позволяющую напрямую нацеливаться на белки, экспрессируемые клетками. Поэтому исследовательская группа начала эту работу, предположив, что можно анализировать exPPI, создав молекулу (FabID), которая соединяет AirID с антиген-распознающим участком антитела, узнающего внеклеточный домен мембранных белков. Исследование опубликовано в журнале Nature Communications.

Для анализа exPPI был выбран рецептор эпидермального фактора роста EGFR — мембранный белок, известный как онкоген. При добавлении FabID и биотина к клеткам карциномы (A431), экспрессирующим EGFR, было подтверждено на уровне клеточной культуры, что EGFR на мембране может быть биотинилирован с помощью FabID.

Комбинируя биотинилирование FabID с масс-спектрометрией, разработанной в Университете Токусимы для анализа биотинилированных белков, исследователи успешно идентифицировали множество новых белков, взаимодействующих с EGFR. Эти белки могут стать новыми мишенями для лекарств.

EGFR передает сигналы в клетку, связываясь с лигандом EGF. Известно, что при связывании EGF с EGFR различные белки связываются с внутриклеточным доменом EGFR, образуя белковый комплекс.

Ингибиторы тирозинкиназы EGFR, широко используемые для лечения рака, как считается, оказывают терапевтический эффект, связываясь с EGFR и ингибируя образование белковых комплексов, опосредованных его внутриклеточным доменом. Однако лиганд-зависимые и лекарственно-зависимые изменения exPPI EGFR при связывании EGF (лиганда) или действии ингибиторов тирозинкиназы EGFR (лекарств) ранее не наблюдались.

Исследователи наблюдали такие изменения exPPI EGFR в культивируемых клетках с помощью FabID. В результате они считают, что впервые в мире обнаружили, что exPPI динамически меняется при связывании лигандов и лекарств с EGFR.

Эффект распространения

Мембранные белки используются почти всеми организмами для передачи информации внутрь и наружу клетки. Поэтому анализ их exPPI, как ожидается, напрямую поспособствует развитию рецепторной биологии. Более того, поскольку большинство коммерческих лекарств действуют, нацеливаясь на мембранные белки, они являются важными мишенями для препаратов.

Однако поиск новых мишеней среди мембранных белков сложен и представляет собой значительную проблему для фармацевтической промышленности. Технология FabID, разработанная в этом исследовании, не только позволяет анализировать exPPI с использованием живых клеток, но и может применяться для идентификации новых мишеней для лекарств.

Кроме того, FabID позволяет улавливать лиганд-зависимые и лекарственно-зависимые изменения exPPI, которые не анализировались традиционными методами. В будущем идентификация новых мишеней для лекарств с помощью анализа exPPI с использованием FabID и детальный анализ изменений exPPI мембранных белков при связывании коммерческих препаратов могут внести значительный вклад в разработку лекарств.

Исследование проводилось как совместный проект Центра Proteo-Science Университета Эхиме, Института передовых медицинских наук Университета Токусимы, Школы наук о жизни Токийского фармацевтического университета, кафедры молекулярной фармакологии Высшей школы медицины Университета Тохоку и кафедры бионаук Института бионауки и технологий Нагахамы.