Изучение клеточной сигнализации с помощью визуализации одиночных молекул

Метод визуализации одиночных молекул (SMI) позволяет наблюдать индивидуальные белки в живых клетках, подсчитывать их количество, отслеживать распределение, движение, конформационные изменения и скорость реакций. Ясуси Сако из Лаборатории клеточной информатики Института перспективных научных исследований RIKEN использует SMI для исследования сложных механизмов клеточной сигнализации.

Начало работы с SMI

В 1998 году Сако впервые удалось наблюдать молекулы в живой клетке с помощью SMI, скопировав существующий прибор. Метод основан на флуоресцентной микроскопии для отслеживания отдельных белков, меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP).

Изучение сети сигнальных белков

Лаборатория Сако исследует, как определяется судьба клетки (деление, дифференцировка, апоптоз). Ключевой интерес представляет эпидермальный фактор роста (EGF), стимулирующий пролиферацию. Сеть сигнальных белков, индуцируемая EGF, включает более 100 белков. SMI позволяет получить количественные данные об отдельных белках в этой сети в живых клетках.

Динамические конформационные изменения рецептора EGFR

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) активируется только при димеризации и связывании EGF с обеих сторон димера. Используя SMI, Сако обнаружил, что для запуска ответа достаточно связывания всего около 300 молекул EGF с примерно 50 000 рецепторами EGFR на поверхности клетки (менее 1%).

Было выявлено, что после димеризации EGFR претерпевает конформационное изменение, которое облегчает связывание EGF с димером в 100 раз. После связывания первой молекулы EGF происходит новое конформационное изменение, облегчающее связывание второй молекулы еще в 10 раз. Это позволяет эффективно запускать сигнальный процесс.

Реакционная память белков

Изучая взаимодействие активированного EGFR с адапторным белком Grb2, исследователи обнаружили неожиданный эффект. При увеличении концентрации Grb2 в 10 раз скорость реакции возрастала только в 3 раза.

Объяснением служит реакционная память: после связывания с Grb2 EGFR меняет конформацию. Даже после диссоциации Grb2 рецептор некоторое время сохраняет "связанную" конформацию, что затрудняет новое связывание. Это позволяет потенциально стабилизировать скорость реакции даже при колебаниях внутриклеточной концентрации Grb2.

Сложность белковых реакций

Традиционно считалось, что разнообразие клеточных ответов обусловлено сложностью сети, а реакции отдельных белков просты (связывание/диссоциация). Открытия, сделанные с помощью SMI, показывают, что реакции отдельных белков также чрезвычайно сложны и контролируют сигнализацию через динамические конформационные изменения и реакционную память.

Перспективы

Для понимания всей сети, включающей около 100 белков, планируется сочетание детального наблюдения ключевых реакций с помощью SMI с математическим моделированием и компьютерным симулированием в сотрудничестве с группами по математической и вычислительной биологии.

Сако также интересует роль флуктуаций (тепловых, численных) в клеточной сигнализации и определении судьбы клетки. Его фундаментальный исследовательский вопрос: где проходит граница между неживым (белок) и живым (клетка), и что значит "быть живым".