Phollow: в реальном времени показано, как вирусы распространяются в кишечном микробиоме
Исследователи из Калифорнийского университета в Ирвайне разработали систему визуализации в реальном времени Phollow, которая отслеживает отдельные бактериофаги по мере их распространения в кишечнике рыбки данио-рерио. Метод показал, что фаги, происходящие от разных бактерий-хозяев, по-разному реплицируются, распространяются и взаимодействуют с тканями хозяина.
Бактериофаги (фаги) — это вирусы, заражающие и убивающие бактерии. Они являются самыми многочисленными биологическими объектами на Земле и одними из первых колонизаторов кишечника человека. В микробиоме человека фаги играют множество ролей: влияют на динамику микробных популяций, выступают формой врожденной иммунной модуляции у новорожденных и повышают приспособленность бактерий, опосредуя горизонтальный перенос генов.
Контролируемые вспышки фагов потенциально могли бы способствовать распространению полезной активности или использоваться для истощения резидентных микробов, которые становятся вредными при определенных условиях. Чтобы продуктивно использовать вспышки фагов, необходимо всесторонне понять их динамику передачи — закономерности того, как фаги реплицируются внутри одного хозяина, передаются другим и влияют на бактериальные сообщества.
Изучение динамики передачи технически сложно, поскольку факторы, управляющие репликацией и передачей фагов in situ, в значительной степени неизвестны. Без контекстуального понимания места и продолжительности репликации фагов или того, находятся ли фаги в форме внеклеточных вирионов или внутриклеточных профагов, прогресс в этой области сильно ограничен.
В исследовании "Phollow reveals in situ phage transmission dynamics in the zebrafish gut microbiome at single-virion resolution", опубликованном в Nature Microbiology, ученые разработали подход визуализации в реальном времени для изучения того, как бактериофаги реплицируются и распространяются в бактериальных сообществах и организмах животных.
Phollow был применен к стерильным рыбкам данио-рерио, колонизированным генетически модифицированными штаммами E. coli и Plesiomonas, что позволило визуализировать поведение фагов с разрешением на уровне отдельного вириона. Исследователи создали флуоресцентно меченые фаги и ввели их в модифицированных бактериальных хозяев, названных Phollow virocells.
Вирусная репликация индуцировалась с помощью антибиотиков, а активность фагов отслеживалась in vivo с использованием:
- Съемки с интервальной съемкой
- Сверхвысокого разрешения микроскопии
- Проточной вирометрии
- Экспансионной микроскопии
Наблюдения показали, что фаги Phollow образуют вирусные агрегаты, которые после лизиса бактерий рассеиваются в облака быстро диффундирующих частиц. Пик индукции вирусной репликации наступал через один час после обработки митомицином C и затрагивал примерно 20% бактериальной популяции.
На пике репликации Phollow virocells содержали в среднем 1.6 вирусных очага на микрометр длины клетки. Трехмерные проекции выявили вирусные очаги с площадью поверхности примерно в 100 раз больше, чем у единичного капсида фага, подобного P2. Просвечивающая электронная микроскопия не обнаружила явных структурных различий между вирионами дикого типа и фагами Phollow.
Проточная вирометрия показала, что митомицин C, ципрофлоксацин и триметоприм индуцировали сопоставимый пиковый выход вирионов. Вспышки, вызванные триметопримом в кишечнике данио-рерио, приводили к образованию облаков фагов по всему кишечнику в течение четырех часов, которые в основном исчезали к 24 часам. Инфекционные вирионы достигали пика в тканях кишечника через четыре часа и сохранялись в окружающей воде более 24 часов. Фаги, происходящие от Plesiomonas, распространялись системно в печень и мозг.
In vitro фаги Phollow реплицировались в новых клетках-хозяевах и подвергались дальнейшей межбактериальной передаче. In vivo вторая волна репликации фагов подтвердила, что произошла горизонтальная передача.
Первоначальное тестирование Phollow демонстрирует его способность обеспечить многоуровневые исследования передачи фагов и межцарственных взаимодействий, что может открыть новые пути для фаг-терапии микробиома.
Методы визуализации в реальном времени и проточной вирометрии могут помочь в экспериментальном дизайне, направленном на изучение механизмов вспышек фагов, что имеет значение для множества неиспользованных клинических возможностей.