TnpB: компактный инструмент для редактирования генома растений
Геномное редактирование позволяет вносить точные изменения в генетический код организмов для развития желаемых признаков. Наиболее распространённые инструменты — белки Cas9 и Cas12a — состоят из 1000–1350 аминокислот, что затрудняет их доставку в клетки.
В статье в Plant Biotechnology Journal представлен новый инструмент — TnpB, компактная нуклеаза для редактирования генома растений.
TnpB — миниатюрный предок Cas12
TnpB (транспозон-ассоциированная нуклеаза, направляемая РНК) считается эволюционным предком Cas12. При функциональном сходстве с Cas12a, TnpB значительно меньше: 350–500 аминокислот, что примерно в три раза компактнее Cas9/Cas12a.
Исследователи разработали гиперкомпактный редактор на основе TnpB из Deinococcus radiodurans (408 аминокислот). Короткая направляющая РНК наводит TnpB на целевую последовательность ДНК, где белок делает двуцепочечный разрез. При репарации клеткой в месте разреза возникают вставки или делеции (indels), модифицирующие генетическую последовательность.
Специфичность редактирования дополнительно обеспечивается необходимостью наличия рядом с мишенью мотива TAM (Transposon Associated Motif), аналогичного PAM у Cas-белков. Для TnpB из D. radiodurans TAM-последовательность — TTGAT. Это позволяет TnpB нацеливаться на участки генома, недоступные для Cas9.
Адаптация TnpB для растений
Для работы в растениях последовательность гена TnpB кодон-оптимизировали, а также оптимизировали регуляторные элементы для производства достаточного количества направляющей РНК. Тестирование четырёх версий векторных систем в протопластах риса выявило наиболее эффективную.
Поскольку системы, работающие в однодольных (например, рис), могут плохо работать в двудольных, были созданы специфичные векторы для двудольных. Успешное редактирование продемонстрировано на Arabidopsis. В обоих случаях в целевых локусах преимущественно наблюдались делеции, что делает TnpB подходящим для эффективного нарушения функции генов. Это можно использовать для удаления антинутриентов, повышения питательной ценности, устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам.
Неактивный dTnpB для активации генов и замены нуклеотидов
Инактивировав режущий домен, создали деактивированный TnpB (dTnpB). Он сохраняет способность связываться с целевой ДНК. При слиянии dTnpB с дополнительными белками-«грузами» их можно доставлять к целевым генам для их активации.
Аналогично, слияние dTnpB с другим эффекторным белком позволило создать инструмент для замены одного нуклеотида ДНК на другой с высокой точностью.
Исследователи используют этот миниатюрный редактор для создания линий риса с улучшенной урожайностью и повышенной устойчивостью к климатическим изменениям. TnpB представлен как универсальный и перспективный инструмент для генной инженерии растений, который может быть принят на вооружение селекционерами и биотехнологами для работы с различными культурами.