Новый метод суперразрешения показал важную роль короткоживущих кластеров ферментов
Исследователи из MIT и Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) обнаружили скрытое, эфемерное явление в клетках, которое может играть важную роль в запуске производства матричной РНК (mRNA) и регуляции транскрипции генов.
В статье, опубликованной в журнале eLife, сообщается, что с помощью новой техники суперразрешающей микроскопии ученые смогли увидеть отдельные молекулы mRNA, выходящие из гена в живой клетке. С помощью этой же техники они наблюдали, что непосредственно перед появлением mRNA фермент РНК-полимераза II (Pol II) собирается в кластеры на том же гене всего на несколько секунд, после чего рассеивается.
Когда исследователи манипулировали кластерами ферментов так, что те оставались вместе дольше, ген производил соответственно больше молекул mRNA. Таким образом, кластеры Pol II могут играть центральную роль в запуске производства mRNA и контроле транскрипции генов.
Ибрагим Сиссе, доцент физики в MIT, объясняет, что из-за своей преходящей природы кластеры ферментов в значительной степени считались загадкой. Новые результаты показывают, что, хотя кластеризация и кратковременна, она может оказывать значительное влияние на основные биологические процессы.
«Мы считаем, что эти слабые и транзитные кластеры являются фундаментальным способом контроля экспрессии генов для клетки», — говорит Сиссе, старший автор статьи. — «Если небольшая мутация немного изменит время жизни кластера, это также может сильно изменить экспрессию гена. Это похоже на очень чувствительную ручку, которую клетка может настраивать».
Более того, теперь ученые могут исследовать кластеры Pol II как мишени для того, чтобы «затормозить или вызвать всплеск транскрипции» и контролировать экспрессию определенных генов, что важно для изучения противораковых препаратов и других генетических терапий.
Визуализация с суперразрешением
Кластеры Pol II существуют очень короткое время — порядка нескольких секунд — и чрезвычайно малы (около 100 нанометров в ширину). Чтобы увидеть эти взаимодействия, команда разработала метод суперразрешающей визуализации для наблюдения клеточных процессов на уровне отдельных молекул.
Техника основана на двух существующих методах — микроскопии локализации фотоактивации (PALM) и стохастической оптической реконструкционной микроскопии (STORM). Ученые модифицировали их, отслеживая не только положение отдельной молекулы, но и частоту ее обнаружения. Чем выше частота обнаружения, тем выше вероятность образования кластера.
Для съемки использовалась камера, записывающая один кадр каждые 50 миллисекунд непрерывно до 10 000 кадров.
Влияние времени жизни кластера
Исследователи создали клеточную линию с флуоресцентной меткой для mRNA и меткой другого цвета для ферментов Pol II. Они наблюдали за хорошо изученным геном бета-актина в живых клетках. Новые кластеры Pol II появлялись на том же гене примерно на 8 секунд, прежде чем распасться.
Поскольку полный процесс производства mRNA занимает около 2,5 минут, оставался вопрос: может ли кластер, существующий лишь малую часть этого времени, влиять на выход mRNA?
Чтобы это выяснить, клетки стимулировали химическим коктейлем, влияющим на транскрипцию. В этих клетках кластеры, сформировавшиеся перед пиком mRNA, оставались стабильными до 24 секунд — вчетверо дольше обычного. При этом количество mRNA увеличивалось пропорционально.
После повторения эксперимента на 207 живых клетках команда установила прямую зависимость между временем жизни кластеров Pol II и количеством mRNA, произведенного с того же гена.
Сиссе предполагает, что кластеры Pol II могут действовать как эффективный драйвер транскрипции, ускоряя в остальном неэффективный процесс.
«Это имеет смысл, ведь вы не хотите, чтобы процесс инициации был эффективным по умолчанию, чтобы случайно не включать любой ген из-за случайного столкновения», — говорит Сиссе. — «Но вам также нужен способ изменить инициацию с неэффективной на эффективную, например, в ответ на стимулы окружающей среды. Мы думаем, что эти транзитные кластеры, вероятно, и есть тот способ, которым клетка может сделать инициацию транскрипции эффективной».
В дальнейшем Сиссе планирует изучить силы, удерживающие кластеры вместе, механизмы их формирования и наличие других молекул, которые могут кластеризоваться с аналогичным эффектом.