Ribose-seq идентифицирует и локализует рибонуклеотиды в геномной ДНК

Рибонуклеотиды, строительные блоки РНК, могут встраиваться в геномную ДНК в ходе процессов репликации и репарации, влияя на стабильность генома и способствуя его хрупкости и мутабельности. Учёные знали о присутствии рибонуклеотидов в ДНК, но до сих пор не могли точно определить, какие именно это рибонуклеотиды и где они расположены в последовательности ДНК.

Исследователи разработали и протестировали новую методику ribose-seq, которая позволяет определить полный профиль рибонуклеотидов, встроенных в геномную ДНК. С её помощью они обнаружили повсеместное, но не случайное встраивание и «горячие точки» накопления рибонуклеотидов в ядерной и митохондриальной ДНК у широко изучаемого вида почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Ribose-seq можно использовать для поиска рибонуклеотидов в ДНК широкого круга других организмов, включая человека.

«Рибонуклеотиды — самые распространённые нестандартные нуклеотиды в ДНК, но до сих пор не было системы для определения их местоположения или идентификации конкретного типа», — говорит Франческа Сторичи, доцент Школы биологии Технологического института Джорджии.

Описание метода ribose-seq и его применения к ДНК дрожжей было опубликовано 26 января в журнале Nature Methods. Работа выполнена в сотрудничестве лаборатории Сторичи и лаборатории доцента Джея Хесселберта из Медицинской школы Университета Колорадо.

Принцип метода

Наличие дополнительной гидроксильной (OH) группы в рибонуклеотиде искажает структуру ДНК и создаёт чувствительные сайты для реакций. Ribose-seq использует реакцию OH-группы с щелочным раствором, которая приводит к разрыву цепи ДНК именно в месте встройки рибонуклеотида.

Метод включает:

1. Расщепление образцов ДНК по рибонуклеотидам.
2. Специализированную обработку полученных фрагментов.
3. Создание библиотеки последовательностей ДНК, содержащих сайты встройки рибонуклеотидов и прилегающие участки.
4. Высокопроизводительное секвенирование библиотеки и картирование прочтений на референсный геном для определения профиля встройки рибонуклеотидов (rNMP).

Ribose-seq специфичен именно к рибонуклеотидам, встроенным в ДНК, и не захватывает РНК-праймеры, фрагменты Оказаки, разрывы или апуриновые/апиримидиновые сайты в ДНК.

Результаты и перспективы

Применение метода к ДНК дрожжей выявило сильное предпочтение цитидиновых и гуанозиновых оснований в сайтах встройки рибонуклеотидов. Их распределение не случайно, обнаружены «горячие точки» встраивания в геноме.

«Наш метод потенциально применим к геному любого типа клеток любого организма, из которого можно выделить геномную ДНК», — отмечает первый автор статьи Кён Дук Ко.

Помимо процессов репарации и репликации, рибонуклеотиды могут появляться в ДНК в результате повреждений, вызванных лекарствами, факторами окружающей среды и другими стрессорами. Ribose-seq позволит изучать влияние этих процессов.

«Идентификация специфических сигнатур встраивания рибонуклеотидов в ДНК может представлять собой новые биомаркеры для таких заболеваний человека, как рак и другие дегенеративные расстройства», — заключает Франческа Сторичи.