Ученые значительно повысили эффективность редактирования генов в стволовых клетках человека

Исследователи из Университета штата Аризона, используя усовершенствованную технологию CRISPR-редактирования оснований, добились эффективности редактирования до 90% в стволовых клетках человека. Это резкий контраст с традиционным подходом CRISPR, где успешное редактирование достигалось лишь в ~10% случаев.

Проблема традиционного CRISPR

  • Низкая эффективность и риск внецелевых эффектов (off-target) затрудняли работу со стволовыми клетками, которые особенно устойчивы к генетическим модификациям.
  • Ученые не могли определить, какие клетки были успешно отредактированы, пока не вырастили их клоны, что делало процесс долгим и неэффективным.

Метод TREE: Зеленый свет для успеха

Новый метод, названный TREE (transient reporter for editing enrichment), основан на редакторах оснований и решает ключевую проблему:

  1. Он делает лишь одиночный разрыв (nick) в цепи ДНК, а не двуцепочечный разрыв, как классический CRISPR.
  2. При успешном редактировании одного нуклеотида (например, с C на T) активируется флуоресцентный репортер, и клетка начинает светиться зеленым.
  3. Это позволяет быстро идентифицировать и отобрать (обогатить) популяцию отредактированных клеток с вероятностью успеха 90%, а затем вырастить из них клональные линии.

"Раньше с CRISPR это была просто случайная догадка... Теперь, если клетка говорит вам: 'Если я светлюсь зеленым, у меня 90% шанс быть отредактированной' — у вас будет гораздо больше успеха", — объясняет Дэвид Брафман.

Нацеливание на болезнь Альцгеймера

В качестве доказательства концепции ученые отредактировали ген APOE в плюрипотентных стволовых клетках, полученных как от здоровых доноров, так и от пациентов с болезнью Альцгеймера.

  • Вариант гена APOE4 является известным фактором риска поздней (спорадической) формы болезни Альцгеймера.
  • TREE не только внес точечные правки, но и с высокой эффективностью отредактировал обе копии гена APOE (гомозиготное редактирование), что традиционно требует многоэтапной и неэффективной процедуры с CRISPR.

Решение сложных случаев

Большинство заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, имеют сложную природу и связаны с множеством генов. Метод TREE продемонстрировал возможность мультиплексного редактирования — одновременного внесения изменений в несколько генов.

  • В экспериментах более 80% клонов стволовых клеток имели редактирования во всех трех целевых локусах, причем снова в обеих копиях генов.
  • Эффективность при мультиплексном редактировании оставалась такой же высокой, как и при редактировании одного гена.

Значение технологии

Метод TREE открывает новые возможности для:

  • Моделирования болезней (создание точных клеточных моделей сложных заболеваний).
  • Скрининга лекарств in vitro.
  • Изучения биологии развития и тканевой инженерии.
  • Быстрого создания нокаутных линий клеток для изучения функции генов.

Исследование опубликовано в журнале Stem Cell Reports.