Влияние праймеров, условий ПЦР и PNA-клэмпов на оценку грибного разнообразия корней растений

Грибы часто обнаруживаются как на поверхности, так и внутри растительных тканей (особенно в корнях) и участвуют в усвоении питательных веществ и устойчивости к патогенам. Поэтому в последние годы растёт интерес к характеристике разнообразия и состава грибных сообществ, ассоциированных с растениями.

Высокопроизводительное секвенирование (HTS), или метабаркодирование, стало ключевым инструментом для изучения сложных микробных сообществ из образцов окружающей среды. Однако применение HTS к грибным сообществам растений затруднено из-за ко-амплификации растительной и грибной ДНК. Гриб-специфичные праймеры, пептидные нуклеиновые кислоты (PNA-клэмпы) или изменение условий ПЦР описываются как эффективные подходы для ограничения загрязнения растительной ДНК.

Исследование под руководством доктора Корали Берто (Университет Франш-Конте) оценило совокупное влияние пар праймеров, соответствующей температуры отжига (Ta) и PNA-клэмпов на определение разнообразия и состава грибных сообществ, связанных с корнями растений.

Были оценены три праймера (fITS7/ITS4, gITS7/ITS4 и 5.8S-Fun/ITS4-Fun), нацеленные на внутренний транскрибируемый спейсер (ITS) 2 рибосомной ДНК, по отдельности или в комбинации с PNA-клэмпами, на ДНК корней крапивы (Urtica dioica) и на синтетическое грибное сообщество.

Команда обнаружила, что PNA-клэмпы не улучшили богатство или разнообразие грибных сообществ, но увеличили количество грибных ридов. Среди протестированных факторов наиболее значимым была пара праймеров. В частности, пара 5.8S-Fun/ITS4-Fun показала более высокое богатство OTU, но меньшее количество грибных ридов.

«Результаты показали, что выбор праймеров критически важен для ограничения ко-амплификации растительной и грибной ДНК. PNA-клэмпы увеличивают количество грибных ридов при нацеливании на ITS2, но не приводят к восстановлению более высокого грибного разнообразия при большой глубине секвенирования. При меньшей глубине чтения PNA-клэмпы могут улучшить количественную оценку микробного разнообразия для пар праймеров, которым не хватает грибной специфичности», — сказала доктор Корали Берто.

Работа опубликована в журнале Mycology.