Упрощённый протокол альтернативного метода вставки генов PITCh
Исследователи из Хиросимского университета (Япония) опубликовали в Nature Protocols детальный протокол для системы PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) — альтернативного метода вставки генов с использованием инструментов геномного редактирования, таких как TALEN и CRISPR-Cas9.
Ключевые особенности системы PITCh:
- Альтернативный путь: В отличие от стандартных методов knock-in, использующих гомологичную рекомбинацию (HR), система PITCh основана на другом пути репарации разрывов ДНК — MMEJ (микрогомология-опосредованное соединение концов).
- Решаемая проблема: Частота HR варьируется в зависимости от типа клеток и организма, что ограничивает применение стандартных методов knock-in. PITCh предлагает альтернативу для случаев с низкой эффективностью HR.
- Применение: Метод способен ускорить исследования в области скрининга кандидатов в лекарства и создания клеточных или животных моделей человеческих заболеваний.
Содержание протокола:
В статье подробно описаны все этапы работы с системой PITCh:
- Конструирование целевого вектора.
- Трансфекция вектора в клетки.
- Отбор клеток с успешной вставкой гена (knock-in).
- Проверка корректности вставки.
Также представлен реальный успешный пример применения и упрощённый метод вставки генов в эмбрионы лягушки. Эта публикация позволит исследователям легко использовать данный мощный инструмент для фундаментальных и прикладных исследований в науках о жизни.