Новый метод позволяет отслеживать структуры РНК в реальном времени в живых клетках
Исследовательские группы доктора Акиры Китамуры (Университет Хоккайдо) и профессора Джеркера Виденгрена (KTH, Швеция) разработали новую методику, способную в реальном времени детектировать характерную структуру РНК в живых клетках. Метод, основанный на флуоресцентной микроскопической спектроскопии, опубликован в журнале Nucleic Acids Research.
Связь с БАС и G-квадруплексами
Одним из генетических факторов, предположительно вовлеченных в развитие бокового амиотрофического склероза (БАС), является специфическая последовательность РНК, формирующая четырехцепочечную структуру — G-квадруплекс. В норме такие структуры регулируют экспрессию генов. Однако мутация в 9-й хромосоме человека приводит к образованию G-квадруплексов, которые могут играть роль в нейродегенеративных заболеваниях, включая БАС.
Суть нового метода
Основным препятствием для понимания роли G-квадруплексов была невозможность изучать их образование и локализацию в живых клетках в реальном времени. Новый метод решает эту проблему.
- Метка: Методика отслеживает цианиновый краситель Alexa Fluor 647 (AF647), которым мечена РНК.
- Принцип детекции: При формировании G-квадруплексов РНК изменяется характер флуоресцентного "мигания" (blinking) красителя.
- Технология измерения: Для детекции этого мигания в реальном времени группы использовали микроскопическую технику TRAST (TRAnsient STate) мониторинга. Она заключается в облучении клеток специфическим паттерном меняющейся интенсивности света и измерении средней интенсивности флуоресценции от красителя в клетках в определенные временные интервалы.
Результаты и перспективы
Команда откалибровала эксперимент в лабораторных условиях, определив, какое именно мигание соответствует G-квадруплексам РНК. На основе этих данных с помощью TRAST удалось определить локализацию РНК G-квадруплексов внутри живых клеток.
Работа доказывает, что цианиновые красители могут служить чувствительными сенсорами состояния свертывания РНК G-квадруплексов в живых клетках, вплоть до уровня единичных клеток. Это открывает возможность изучения роли этих структур в заболеваниях в реальном времени на внутриклеточном уровне. Метод также может быть применен для исследования сворачивания и misfolding белков в клетках.