Разработаны редакторы праймов на основе Cas12a и кольцевых РНК в клетках человека

В исследовании, опубликованном в Nature Biotechnology, группа Гао Цайся из Института генетики и биологии развития Китайской академии наук разработала серию новых редакторов праймов на основе белка Cas12a, расширив возможности таргетного редактирования генома.

Редактирование праймами (PE) позволяет осуществлять точные вставки, делеции и замены ДНК. До сих пор все эффективные редакторы праймов были основаны на Cas9. Однако у Cas9 есть недостатки, ограничивающие широкое применение: большой размер, более высокий уровень нецелевого редактирования и ограниченная эффективность в G/C-богатых регионах.

Решение этих проблем расширит возможности PE. По сравнению с Cas9, белок Cas12a и его crRNA имеют меньший молекулярный размер, что облегчает доставку. Кроме того, Cas12a обладает более низким нецелевым эффектом и лучше таргетирует A/T-богатые регионы благодаря своему уникальному T-богатому PAM-предпочтению.

Известно, что Cas12a расщепляет собственную crRNA, что делает его непригодным для работы с традиционными pegRNA, так как он будет расщеплять расширения праймер-связывающего сайта (PBS) и матрицы обратной транскриптазы (RTT).

Используя различные мутантные версии Cas12a, исследователи разработали набор различных редакторов праймов, опосредованных кольцевой РНК (CPE), для различных сценариев редактирования:

• CPE, зависимый от никаза (niCPE)
• CPE, зависимый от нуклеазы (nuCPE)
• CPE, зависимый от разделенного никаза (sniCPE)
• CPE, зависимый от разделенной нуклеазы (snuCPE)

В клетках HEK293T nuCPE и snuCPE достигли эффективности редактирования до 10.42% и 3.19% соответственно. Редакторы niCPE и sniCPE показали еще более высокую эффективность — 24.89% и 40.75% соответственно.

Помимо клеток HEK293T, niCPE и sniCPE также эффективно выполняли точное редактирование в клетках HeLa, N2A и MCF7. Важно, что за счет разделения обратных транскриптаз системы sniCPE и snuCPE в конечном итоге могут быть доставлены с использованием систем AAV.

Исследователи продемонстрировали эффективное мультиплексное редактирование праймами, экспрессируя все РНК, содержащие кольцевую РНК, одновременно под одним промотором. С помощью этого подхода они показали эффективное редактирование двух, трех и даже четырех генов.

Оценка нецелевых эффектов CPE показала, что эти системы действительно обладают отличной специфичностью. Новый набор систем CPE с низким нецелевым эффектом и высокой эффективностью редактирования дает ориентиры для разработки будущих редакторов праймов на основе других нуклеаз с различными размерами и таргетными возможностями.

Эти системы CPE имеют большой потенциал в биологических исследованиях, лечении заболеваний и селекции сельскохозяйственных культур.