Исследователи используют наноскопические поры для изучения структуры белка
Исследователи из Пенсильванского университета продвинулись в разработке нового метода секвенирования, при котором основания нити ДНК считываются по мере её прохождения через наноскопическое отверстие.
В новом исследовании они показали, что эту технику можно также применять к белкам, чтобы узнать больше об их структуре.
Существующие методы такого анализа трудоёмки и обычно требуют сбора больших количеств белка. Они также часто требуют модификации белка, что ограничивает их полезность для понимания поведения белка в его естественном состоянии.
Техника транслокации исследователей из Пенна позволяет изучать отдельные белки без их модификации. Таким способом можно анализировать образцы, взятые у одного человека, что открывает возможности для диагностики и исследований заболеваний.
Исследование было опубликовано в журнале ACS Nano.
Техника команды из Пенна основана на работе Марии Дрндич по нанопоровому секвенированию генов, цель которого — различать основания в нити ДНК по разному проценту блокировки апертуры, когда они проходят через нанопору. Разные силуэты пропускают разное количество ионной жидкости. Изменение потока ионов измеряется электроникой вокруг поры; пики и впадины этого сигнала можно соотнести с каждым основанием.
Пока исследователи работают над повышением точности этих измерений до полезного уровня, Дрндич и её коллеги экспериментировали с применением техники к другим биологическим молекулам и наноструктурам.
Сотрудничая с группой Джеффри Г. Сейвена, они решили испытать свои поры на ещё более сложных биологических молекулах.
«Существует множество белков, которые намного меньше и сложнее в обращении, чем нить ДНК, и которые мы хотели бы изучить», — сказал Сейвен. «Нас интересует структура данного белка, например, существует ли он в виде мономера, или в комбинации с другой копией в виде димера, или агрегата из нескольких копий, известного как олигомер».
Ограничением также часто является детекция.
«Не существует способов амплифицировать пептиды и белки, как для ДНК», — сказала Дрндич. «Если вы хотите изучать белки из определённого источника, у вас есть только очень маленькие образцы. Однако с этим методом вы можете просто собрать необходимое количество данных и нужное число белков, которые должны пройти через пору, а затем изучать их по одному в том виде, в каком они естественно существуют в организме».
Используя нитрид-кремниевые нанопоры группы Дрндич, которые можно сверлить до заданных диаметров, исследовательская группа испытала свою технику на белке GCN4-p1, выбранном потому, что он содержит общий структурный мотив, встречающийся в факторах транскрипции и внутриклеточных рецепторах.
«Димерная версия "застёгнута" вместе, — сказал Дэвид Недзвецки. — Это "свёрнутая спираль" из переплетённых спиралей, примерно цилиндрической формы. Мономерная версия "расстёгнута" и, вероятно, не спиральная; она больше похожа на нить».
Исследователи помещали разные соотношения «застёгнутых» и «расстёгнутых» версий белка в ионную жидкость и пропускали их через поры. Хотя они не могли различить отдельные белки, исследователи могли проводить этот анализ на популяциях молекул.
«Димерная и мономерная формы белка блокируют разное количество ионов, поэтому мы видим разное падение тока, когда они проходят через пору, — сказал Недзвецки. — Но мы получаем диапазон значений для обеих форм, так как каждое событие транслокации молекулы уникально».
Определение того, агрегируют ли определённые образцы таких белков или нет, можно использовать для лучшего понимания прогрессирования заболевания.
«Многие исследователи наблюдали эти длинные клубки агрегированных пептидов и белков при таких заболеваниях, как Альцгеймер и Паркинсон, — сказал Сейвен, — но появляется всё больше доказательств, что эти клубки образуются постфактум, а реальные проблемы вызывают более мелкие белковые ассамблеи. Выяснить, что это за ассамблеи и какого они размера, в настоящее время очень сложно, так что это может быть способом решить эту проблему».