NanoCas: ультракомпактная система CRISPR для редактирования генов в мышцах с помощью одного вектора AAV

Исследователи из Mammoth Biosciences разработали NanoCas — ультракомпактную нуклеазу CRISPR. В экспериментах на нечеловекообразных приматах (NHP) система, доставляемая одним вектором адено-ассоциированного вируса (AAV), показала эффективность редактирования в скелетных мышцах свыше 30%.

Проблема доставки CRISPR

Классические нуклеазы CRISPR (Cas9, Cas12a) слишком велики для упаковки в один вектор AAV, что требует менее эффективных стратегий с двумя AAV. Существующие компактные системы (Cas12i, CasX, Cas14, IscB) либо остаются крупными, либо демонстрируют низкую эффективность редактирования in vivo.

Поиск и оптимизация NanoCas

В исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv, учёные провели метагеномный скрининг 21 980 метагеномов. Из 176 кандидатов размером менее 600 аминокислот была выбрана самая эффективная нуклеаза — NanoCas.

Её дополнительно оптимизировали с помощью белковой инженерии. Вариант с заменой аргинина в позиции 220 (D220R) улучшил связывание с ДНК и эффективность редактирования в клетках HEK293T, T-клетках и CD34+ гемопоэтических стволовых клетках.

Результаты экспериментов in vivo

  • На мышах: Доставка NanoCas вектором AAV8 для редактирования гена Pcsk9 в печени привела к эффективности ~60% и снижению уровня белка PCSK9 в сыворотке.
  • На модели мышечной дистрофии Дюшенна (DMD): В гуманизированной мышиной модели редактирование сайтов сплайсинга в гене дистрофина показало эффективность 10–40% в тканях квадрицепса, икроножной мышцы и сердца.
  • На нечеловекообразных приматах: Системная инъекция AAV9-NanoCas макакам-крабоедам привела к:
    • Редактированию в скелетных мышцах на уровне до 30%, с прогрессивным увеличением со временем.
    • Редактированию в сердце на уровне ~15%.
    • Минимальному внецелевому редактированию в печени (<2%).

Значение работы

NanoCas — первая система CRISPR, доставляемая одним вектором AAV, которая продемонстрировала эффективное редактирование генов в мышцах нечеловекообразных приматов. Это открывает возможности для терапии заболеваний скелетных мышц и сердца, а также для других направлений точного редактирования генома.