Улучшение мультиплексного мутагенеза повышает эффективность редактирования генома растений

CRISPR/Cas9 остается самым мощным инструментом для создания мутаций в геномах растений. Изучение различных комбинаций мутаций значительно увеличило масштаб экспериментов, потребовав больше места для выращивания множества растений.

Исследователи из VIB-UGent Center for Plant Systems Biology усовершенствовали мультиплексный мутагенез, что снижает сложность и стоимость крупномасштабных проектов по редактированию генома. Их результаты опубликованы в The Plant Journal.

Эксперименты с CRISPR/Cas постоянно увеличиваются в масштабе — как по количеству создаваемых мутантов, так и по числу генов, которые можно мутировать одновременно. Лаборатория Томаса Джейкобса разработала скрининги для систематического мутирования десятков, сотен или даже тысяч генов за раз.

Цель — повысить эффективность наследуемых зародышевых мутаций и, в конечном счете, снизить сложность и стоимость крупных геномных проектов.

Для этого команда сосредоточилась на двух ключевых аспектах дизайна вектора CRISPR/Cas9: промоторе для экспрессии Cas9 и сигналах ядерной локализации (NLS), направляющих белок в ядро. Генотипирование тысяч растений Arabidopsis показало, что использование промотора RPS5A для экспрессии Cas9 дает наивысшую частоту мутаций, а фланкирование белка Cas9 бипартитными NLS — наиболее эффективная конфигурация для создания зародышевых мутаций.

Сочетание этих двух элементов дает максимальную наблюдаемую эффективность мультиплексного редактирования: 99% растений имеют хотя бы одну нокаутную мутацию, а более 80% — от 4 до 7 мутаций.

«Это значительный прогресс в области генетики растений, который предоставляет надежный и эффективный инструмент для исследований в сложной генной инженерии. Особенно интересен эффект NLS — я осмелюсь сказать, он был сильнее, чем эффект промотора», — сказал доктор Томас Джейкобс.

Оптимизации, достигнутые в исследовании, значительно снижают сложность и стоимость крупных проектов. В цифрах: с их прежним вектором для скрининга всех двойных нокаутов всего 20 генов требовалась популяция около 18 000 растений. С новыми векторами потребуется около 3 000 растений.

«Эти оптимизации будут полезны для создания множественных нокаутов в зародышевой линии Arabidopsis и, вероятно, применимы к другим системам CRISPR», — сказал аспирант и ведущий автор работы Вард Девелтере.