Открытие фермента позволило впервые получить ароматическое биотопливо с помощью микробов

Исследователи из Объединённого института биоэнергетики Министерства энергетики США (JBEI) и Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли обнаружили новый фермент, который позволит микробам производить возобновляемую альтернативу нефтехимическому толуолу. Толуол широко используется как октановый усилитель в бензине, его мировой рынок составляет 29 миллионов тонн в год.

Результаты исследования под руководством Гарри Беллера, старшего научного сотрудника лаборатории в Беркли и научного руководителя в JBEI, были опубликованы в журнале Nature Chemical Biology. Соавторами выступили Андрия Родригес и Камрун Заргар из JBEI.

Ключевая задача исследований в JBEI и в сообществе учёных, работающих над биотопливом, — производство промышленно и коммерчески значимых топлив и химикатов из возобновляемых источников, таких как лигноцеллюлозная биомасса, а не из нефти. Открытый в этом исследовании фермент позволит впервые получить биотолуол с помощью микробов и, по сути, станет первым случаем микробного производства любого ароматического углеводородного биотоплива.

Открытие фермента стало результатом интенсивного изучения двух различных микробных сообществ, продуцирующих толуол. Одно сообщество состояло из микробов из донных отложений озера, другое — из осадка сточных вод. Поскольку микробы в окружающей среде являются резервуаром ферментов, катализирующих чрезвычайно разнообразные химические реакции, для учёных в биотехнологии не редкость искать ферменты в природе.

Беллер заинтересовался биотолуолом после прочтения научных публикаций 1980-х годов, в которых сообщалось о микробном биосинтезе толуола в бескислородных (анаэробных) донных отложениях озёр. Несмотря на ряд последующих сообщений о бактериальном производстве толуола, идентичность фермента, катализирующего эту сложную биохимическую реакцию, оставалась загадкой на протяжении десятилетий.

Обнаруженный в этом исследовании толуол-синтезирующий фермент, фенилацетатдекарбоксилаза, принадлежит к семейству глицил-радикальных ферментов (GRE). Учёные начали узнавать о GRE только в 1980-х годах, и фенилацетатдекарбоксилаза является лишь восьмым типом реакции GRE, который был открыт и охарактеризован с тех пор. Однако метагеномные данные, представленные в исследовании JBEI и других работах, указывают на то, что в природе существует гораздо больше ещё не охарактеризованных GRE.

Радикальная природа GRE позволяет им катализировать химически сложные реакции, такие как анаэробное декарбоксилирование фенилацетата с образованием толуола. Помимо потенциальных биотехнологических применений, ряд известных GRE важны для здоровья человека и встречаются в микробиоме кишечника.

Процесс открытия фермента для этого проекта был сложным и нетривиальным. Исследователи сначала работали с видом бактерий, о котором сообщалось, что он производит толуол, но когда эти данные оказались невоспроизводимыми, учёные обратились к окружающей среде — к муниципальным сточным водам и анаэробным донным отложениям озера.

«Все проекты по открытию ферментов сложны. Но переход от открытия у одного вида бактерий к открытию в сложном микробном сообществе из осадка сточных вод или озёрных отложений был сложнее на порядки», — говорит Беллер. — «Это исследование стало поиском иголки в стоге сена — фермента, производящего толуол, среди сотен тысяч кандидатов».

Метагеномный анализ показал, что эти микробные сообщества содержали более 300 000 генов каждый — эквивалент более 50 бактериальных геномов. Другой сложностью была чувствительность анаэробных микробных сообществ и многих их ферментов к кислороду, что заставляло учёных работать с культурами и ферментами в строго анаэробных условиях.

Процесс открытия сочетал методы очистки белков, используемые биохимиками десятилетиями (например, высокоэффективную жидкостную хроматографию), с современными метагеномными, метапротеомными и биоинформатическими анализами, некоторые из которых проводились в сотрудничестве с Объединённым институтом генома. Важным компонентом процесса открытия была экспериментальная проверка предсказаний учёных о ферменте биосинтеза толуола с помощью высококонтролируемых анализов с использованием очищенных белков.

Интригующий вопрос, возникающий из этого исследования: зачем бактерии производить толуол? У исследователей нет окончательного ответа, но в статье представлены две гипотезы. Одна возможность заключается в том, что бактерия производит толуол как токсин, чтобы вытеснить другие микробы в своей среде. Другая гипотеза предполагает, что реакция фенилацетатдекарбоксилазы (образующей толуол) является стратегией бактерии для регулирования своего внутреннего pH в несколько кислой, ферментативной среде.

Беллер и его коллеги считают, что результаты их исследования важны как для фундаментальной, так и для прикладной науки. С биохимической точки зрения исследование расширяет известный каталитический диапазон GRE, а с биотехнологической — позволит впервые осуществить биохимический синтез ароматического углеводородного топлива из возобновляемых ресурсов.

«Нам ещё так много предстоит узнать об удивительном метаболическом разнообразии бактерий, — сказал Беллер. — За эоны эволюции природа разработала ферменты, способные катализировать сложные химические реакции, и, открывая их, мы можем использовать их в биотехнологии».