Метод масс-спектрометрии представляет новую концепцию для характеризации белков in cell

Белки в клетках высокофлексибельны и часто существуют в нескольких конформациях, каждая из которых обладает уникальной способностью связывать лиганды. Эти конформации регулируются организмом для контроля функции белка. В настоящее время большинство исследований структуры и активности белков проводятся с использованием очищенных белков in vitro, что не может полностью воспроизвести сложность внутриклеточной среды и может быть подвержено влиянию процесса очистки или условий буфера.

В исследовании, опубликованном в Journal of the American Chemical Society, группа под руководством профессора Ван Фанцзюня из Даляньского института химической физики Китайской академии наук (CAS) в сотрудничестве с профессором Хуан Гуанмином из Научно-технического университета Китая CAS разработала новый метод для характеризации белков in cell с использованием вакуумной ультрафиолетовой фотодиссоциации в топ-даун масс-спектрометрии (UVPD-TDMS). Метод предоставляет инновационную технологию для анализа гетерогенности внутриклеточных белков in situ с помощью MS.

Исследователи объединили in-cell MS с 193-нм UVPD для прямого анализа белковых структур внутри клеток. Метод использовал индуцированную ионизацию электрораспылением, которая ионизирует внутриклеточные белки с минимальным структурным возмущением.

Распределения зарядовых состояний внутриклеточных белков были проанализированы для определения их конформационных ансамблей. UVPD применялась для возбуждения и диссоциации белковых остовов, генерируя обильные a-, b-, c-, x-, y- и z-фрагментные ионы, которые богаты особенностями структуры и взаимодействий белка.

Кроме того, исследователи применили этот новый метод для прямой ионизации и детекции высокоэкспрессируемого кальмодулина (CaM) из клеток E. coli. Они обнаружили, что внутриклеточный CaM существует в трёх основных сосуществующих конформациях, причём вытянутая конформация была значительно более распространена, чем форма, обнаруженная у очищенного CaM.

Также исследователи использовали UVPD-TDMS для изучения форм связывания и структурных характеристик различных Ca²⁺-связывающих вариантов CaM. Они обнаружили, что способность CaM связывать Ca²⁺ регулируется конформационно-зависимым образом: компактная конформация показала более высокое сродство к Ca²⁺, чем вытянутая форма.

Также было выявлено, что первые два иона Ca²⁺ предпочтительно связываются с EF-2 и EF-3 в компактной конформации, в то время как вытянутая форма благоприятствует связыванию с EF-3 и EF-4 в C-доле белка.

«Наше исследование представляет новую концепцию для характеризации белков in cell. Точный подбор массы и распределения заряда позволяет in-cell UVPD-TDMS проводить детальную характеризацию внутриклеточных белковых вариантов и конформаций. Этот метод продемонстрировал преимущества в анализе белковой гетерогенности», — сказал профессор Ван.