Определение эффективности фотоактивации флуоресцентных белков для молекулярного счёта

Знание количества белков, собирающихся вместе в наномасштабе, важно для понимания их функции. Способность определять стехиометрию белков и баланс между мономерными, димерными и мультимерными формами позволяет увидеть разницу между здоровой и больной клеткой.

Исследовательская группа под руководством д-ра Мелике Лакадамяли в ICFO смогла количественно оценить эффективность фотоактивации всех известных «необратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков» и создать детальную эталонную систему для определения стехиометрии белков. Для этого использовался наношаблон известной стехиометрии — рецептор глицина человека, экспрессированный в ооцитах Xenopus. Результаты опубликованы в Nature Methods.

Молекулярный счёт становится возможным благодаря фотоактивируемым белкам и микроскопии сверхвысокого разрешения. Эти белки «включаются» (становятся яркими) под лазерным светом, что позволяет отслеживать их по одному. Однако связать число подсчитанных флуоресцентных меток с реальной стехиометрией белка было сложно. Ключевая проблема: не было известно, активируются ли все флуоресцентные белки под светом. Неактивированные метки остаются тёмными и не видны, что приводит к занижению счёта.

Измерив эффективность фотоактивации и другие фотофизические параметры (например, мигание), группа определила, какие белки лучше всего подходят для молекулярного счёта. Выяснилось, что идеальных белков нет — большинство флуоресцентных белков не активируются примерно в 50% случаев. Поэтому для корректной интерпретации количественных данных необходимо учитывать эффективность фотоактивации.

«Сейчас нам приходится работать с несовершенными флуоресцентными белками и учитывать их ограничения при определении стехиометрии. Однако теперь, когда есть надёжный способ охарактеризовать эффективность фотоактивации, будущая работа по белковой инженерии, вероятно, сосредоточится на оптимизации этого параметра», — отмечает д-р Лакадамяли.

Группа сочетает передовые методы визуализации одиночных молекул, чтобы изучать, как организация, динамика и стехиометрия белков связаны с их функцией в таких процессах, как внутриклеточный транспорт, аутоиммунные неврологические расстройства или репрограммирование стволовых клеток.