Исследование кольцевой ДНК завершает полный круг благодаря старой методике
50-летняя лабораторная методика помогает исследователям лучше понять кольцевую ДНК — менее известного и плохо изученного «родственника» линейной версии, обычно ассоциируемой с генетическим планом жизни.
С помощью процесса, называемого центрифугированием в градиенте плотности, исследовательская группа, в которую вошли ученые из Техасского университета в Далласе и Медицинской школы Стэнфордского университета, недавно опубликовала исследование, впервые охарактеризовавшее всю кольцевую ДНК в черве C. elegans, а также в трех типах человеческих клеток.
Что такое кольцевая ДНК?
Молекулы ДНК, составляющие гены и хромосомы в наших клетках, представляют собой веревкообразные нити со свободными концами, имеющие форму скрученной лестницы или спирали. Эта ДНК, называемая хромосомной, находится в ядре каждой клетки и содержит генетические инструкции, необходимые для выполнения биологических функций.
Но существует другая популяция ДНК, называемая внехромосомной кольцевой ДНК, которая имеет форму круга без свободных концов и существует независимо от линейной ДНК. Хотя исследователи начинают лучше понимать, как кольцевая ДНК функционирует у людей, многое еще неизвестно. Исследование, недавно опубликованное в журнале G3: Genes, Genomes and Genetics, показало, что разные типы клеток содержат разные наборы кольцевых ДНК.
«Интересно, что разные типы клеток, по-видимому, имеют разные репертуары этих колец, даже у одного и того же человека», — сказала ведущий автор исследования доктор Масса Шоура, научный сотрудник-постдок Фонда Бекмана в Стэнфорде. — «Они не все одинаковы — кольца в ваших клетках кожи могут отличаться от колец в моих».
«Циркулом» может предсказывать болезни
Как в черве, так и в человеческих клетках исследователи наблюдали кольца, которые были копиями кодирующих областей на хромосомной ДНК — областей, содержащих гены для создания специфических белков. Хотя у исследователей есть некоторые предположения о том, как создается такая кольцевая ДНК, точные процессы плохо изучены.
«Мы думаем, что у них разные функции и разные механизмы их генерации, но необходимо гораздо больше исследований», — сказала Шоура. — «Одна из вещей, которую мы пытаемся выяснить, — существуют ли специфические репертуары кольцевой ДНК — термин, который мы придумали как «циркулом», — характерные для различных патологий, таких как рак».
Например, Шоура и ее коллеги исследуют, существуют ли заметные различия между циркуломом в здоровой ткани и ткани рака толстой кишки у одного и того же человека. Если да, то кольцевая ДНК предлагает потенциальный диагностический биомаркер для рака.
«Чтобы установить кольцевую ДНК в качестве биомаркера болезни, мы сначала должны иметь метод надежного и чистого выделения кольцевой ДНК из образца, ее очистки, чтобы мы знали, что изучаем только кольца, без примеси других генетических материалов», — сказала она. — «Здесь пригодилась моя подготовка в UT Dallas».
Старое снова становится новым
До того как присоединиться в 2015 году к лаборатории нобелевского лауреата доктора Эндрю Файра в Стэнфорде, Шоура была аспирантом в лаборатории доктора Стивена Левена в UT Dallas. Для исследования, опубликованного в G3, соавторами которого также являются Файр и Левен, команда использовала опыт Левена и Шоуры со старой лабораторной методикой — центрифугированием в градиенте плотности. Разработанный 50 лет назад — и теперь, по словам Левена, редко используемый — этот метод разделяет ДНК на основе плотности.
Левен и Шоура заявили, что эта техника превосходит более современные методы анализа.
«Я использую эту технику выделения ДНК со времен аспирантуры и до сих пор считаю ее лучшим методом для получения чистого образца кольцевой ДНК», — сказал Левен, профессор биоинженерии.
В этом процессе ДНК смешивают с плотным солевым раствором, содержащим хлорид цезия, в небольшой пробирке вместе с красителем, который связывается как с линейной, так и с кольцевой ДНК. Краситель связывается с каждым типом ДНК по-разному, в результате чего линейная ДНК становится менее плотной, чем кольцевая. Когда образец вращают в ультрацентрифуге на высоких скоростях (около 120 000 об/мин), более плотная кольцевая ДНК концентрируется в полосе у дна пробирки.
Исследователи также подвергли свои образцы дополнительным, более современным методам очистки, чтобы дополнительно гарантировать чистоту образца кольцевой ДНК.
«Это исследование ясно показывает, что кольцевая ДНК является частью генома; она играет роль в нормальной обработке ДНК», — сказала Шоура. — «Чем больше мы ее изучаем, тем больше понимаем, что человеческий геном более динамичен, чем мы думали».