Вводящие в заблуждение изображения в клеточной биологии
Долгое время считалось, что свет нельзя использовать для визуализации структур, размер которых меньше половины его длины волны — это был предел разрешения световой микроскопии. Однако развитие микроскопии сверхвысокого разрешения показало, что в этом правиле есть лазейки. Визуализируя отдельные молекулы в разные моменты времени, их точные положения можно в итоге объединить в одно чёткое изображение. В 2014 году за эту идею была присуждена Нобелевская премия по химии. С тех пор методы микроскопии сверхвысокого разрешения, такие как STORM и PALM, стали популярными для изучения организации белков в клеточной мембране.
Неожиданно многие исследовательские группы обнаружили, что практически все изучаемые белки образуют кластеры в клеточной мембране. Во время работы над такими белковыми кластерами исследователи из TU Wien сделали неожиданное открытие. Часто предполагаемые кластеры на самом деле являются одиночными мигающими молекулами, которые подсчитываются несколько раз. Новый метод, который команда представила в журнале Nature Methods, может отличать настоящие кластеры от таких артефактов.
Современная визуализация для клеточной биологии
«Для многих важных проблем в медицине и биологии крайне важно понимать структуру клеточной мембраны», — говорит Флориан Баумгарт из исследовательской группы биофизики под руководством профессора Герхарда Шютца в TU Wien. «Микроскопия сверхвысокого разрешения — идеальный инструмент для изучения пространственного расположения белков на клеточной мембране. Наше исследование сосредоточено на Т-клетках, которые могут распознавать антигены и поэтому играют важную роль в нашей иммунной системе».
Чтобы применить микроскопию сверхвысокого разрешения к биологическим образцам, белки метят флуоресцентными молекулами (так называемыми флуорофорами). В классической флуоресцентной микроскопии одиночный флуорофор виден не как чёткая точка, а как размытый круг. Следовательно, если все эти молекулы светятся одновременно, их изображения перекрываются, и информация об их точном пространственном расположении теряется. С помощью химических уловок или специальных протоколов освещения можно заставить флуорофоры светиться в разные моменты времени. Делается серия снимков, на каждом из которых видны лишь несколько хорошо разделённых флуорофоров. Затем компьютерная программа определяет точное положение молекул на каждом изображении. Это, наконец, позволяет реконструировать одно изображение высокого разрешения из всех определённых положений отдельных молекул.
Загадочные кластеры
«В последние годы различные исследовательские группы изучали, как белки распределены на клеточных мембранах. Снова и снова они обнаруживали, что почти все белки образуют кластеры, а не занимают случайные позиции», — говорит Флориан Баумгарт.
На первый взгляд, это кажется логичным. Известно, что при распознавании антигена Т-клетки могут создавать стабильные белковые кластеры, достаточно большие, чтобы их можно было увидеть даже с помощью классической флуоресцентной микроскопии. Крошечные наноскопические белковые кластеры считались предшественниками этих более крупных структур — с большим значением для функции Т-клеток.
Флориан Баумгарт тоже искал эти нанокластеры. Но микроскопия сверхвысокого разрешения — сложное дело со множеством возможных источников ошибок. Данные необходимо тщательно оценивать, чтобы получить надёжные результаты. Иногда молекулы могут светиться несколько раз, что легко можно принять за кластер молекул.
«Мы думали о том, как можно отличить кластеры попеременно светящихся молекул от одной молекулы, которая мигает многократно», — говорит Флориан Баумгарт. Решающей стала идея варьировать концентрацию флуорофоров. «На снимках кластеры и одиночные мигающие молекулы может быть трудно отличить друг от друга, но статистические свойства распределения меняются, когда мы увеличиваем концентрацию флуорофора». Если меченые молекулы действительно образуют кластеры, при использовании большего количества флуоресцентных меток становится видно всё больше положений молекул. Но между кластерами остаются тёмные пространства. Если же это случайно распределённые молекулы, светящиеся несколько раз, то в конечном итоге растущее количество флуоресцентных молекул покроет всю поверхность, не образуя кластеров в каком-либо конкретном регионе.
«Таким образом мы выяснили, что интересующие нас мембранные белки вообще не образуют кластеров — эту теорию придётся отбросить», — говорит Флориан Баумгарт. «Однако существуют примеры белков, которые действительно образуют кластеры. Мы смогли показать, что изображения этих белков имеют совершенно другие статистические свойства».
Этот метод различения кластеров и мигающих молекул был опубликован в журнале Nature Methods. Ожидается, что он поможет в интерпретации данных сверхвысокого разрешения и может стать важным инструментом для понимания структурной организации плазматической мембраны.