Метод отслеживания предсказывает максимально возможное разрешение в микроскопии

Ученые из TU Delft выявили фундаментальные ограничения сверхразрешающей микроскопии и предложили новый расчетный метод для определения максимального достижимого разрешения. Эта технология важна для изучения процессов в живой клетке, выявления причин заболеваний и разработки новых лекарств. Результаты опубликованы в Biophysical Journal.

В 2019 году исследователи из Делфта уже значительно улучшили точность методики примерно в два раза. Теперь они опубликовали статью, указывающую на принципиальные ограничения сверхразрешающей микроскопии. «Мы также предоставляем метод, который поможет другим исследователям делать более обоснованный выбор», — говорит аспирант и первый автор публикации Дилан Калисварт.

Исследователи под руководством Карласа Смита заложили новые основы для метода итеративной микроскопии локализации одиночных молекул (iterative single-molecule localization microscopy). Они используют паттерны освещения, чтобы «приблизиться» к отдельным молекулам, используя данные предыдущих экспериментов для размещения паттернов всё ближе к молекулам. Это позволяет повысить резкость изображения именно там, где находятся молекулы.

Калисварт объясняет: «Мы показываем (с помощью так называемого неравенства Ван Триса), что улучшение разрешения можно объяснить априорными знаниями, полученными из предыдущих экспериментов. Это позволяет нам продемонстрировать, какими должны быть практические настройки микроскопа в данных обстоятельствах и при имеющихся знаниях, чтобы достичь наилучшего результата».

Сверхразрешающая микроскопия

Сверхразрешающая микроскопия — это революционная технология, позволяющая заглянуть внутрь живых клеток. В ней используются светящиеся белки, например, из медуз. В 2008 году три ведущих исследователя получили Нобелевскую премию по химии за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка (GFP). Эти флуоресцентные белки можно прикрепить к молекулам с помощью редактирования генов. При освещении лазером они испускают небольшое количество света.

Микроскопия локализации одиночных молекул (SMLM) обеспечивает случайное включение или выключение молекул. Чувствительные сенсоры записывают видео этих световых сигналов, после чего исследователи анализируют полученные данные. Это позволяет очень точно определить местоположение молекул и реконструировать структуру клетки. Обычный оптический микроскоп позволяет получать изображения в масштабе около половины микрона. Сверхразрешающая микроскопия увеличивает эту способность примерно в десять раз.

Развитие сверхразрешающей микроскопии

В 2014 году три исследователя получили Нобелевскую премию по химии за разработку сверхразрешающей микроскопии. Одним из лауреатов был немецкий исследователь Штефан Хелл. В 2020 году ученые из его лаборатории заявили, что итеративная микроскопия локализации одиночных молекул позволит значительно улучшить разрешение. Теперь ученые из TU Delft показывают, что эти значительные улучшения разрешения практически недостижимы на практике.

Калисварт: «В практической ситуации лучшее, на что можно надеяться, — это улучшение примерно в пять раз по сравнению со стандартной техникой. В научном сообществе в основном предполагалось, что потенциал гораздо больше. Мы впервые рассмотрели эту проблему с другой математической (байесовской) точки зрения и показали, что улучшения разрешения, о которых говорила группа Хелла, трудно достичь на практике».

Будет ли публикация в Biophysical Journal воспринята как неудача? «Я так не считаю», — говорит руководитель Калисварта Карлас Смит. «Важно, чтобы фундаментальная наука была достоверной. Если что-то не так со структурой, нужно вернуться на базовый уровень, чтобы перестроить фундамент».