Исследователи изучили отдельную клетку с помощью передовых методов рентгеновской визуализации
Каждое растение, животное и человек — это сложный микрокосм из крошечных специализированных клеток. Увидеть их внутреннее устройство с нанометровым разрешением, не повредив хрупкие органеллы, было сложной задачей. Ученые из Брукхейвенской национальной лаборатории Министерства энергетики США (DOE) нашли эффективный способ визуализации отдельной клетки, комбинируя несколько методов. Работа опубликована в Communications Biology.
Понимание внутренней структуры клеток, взаимодействий химических веществ и белков внутри них на нанометровом уровне может иметь большое значение для медицины, сельского хозяйства и других областей. Это также прокладывает путь к улучшению методов биологической визуализации.
«Изучение человеческих клеток и их органелл — это захватывающе, — говорит структурный биолог Цюнь Лю, — но наш мультимодальный подход, сочетающий рентгеновскую компьютерную томографию и флуоресцентную микроскопию, открывает множество возможностей. Мы можем изучать патогенные грибы или полезные бактерии, видя не только их структуру, но и химические процессы при взаимодействии клеток».
Подготовка образца
Исследователи выбрали клетку линии человеческих эмбриональных почек (HEK) 293. Эти клетки легко культивировать, но сложно изучать с помощью многократных рентгеновских измерений, так как они чувствительны к повреждениям от излучения.
Чтобы сделать образец более устойчивым, ученые провели многоступенчатую подготовку:
- Химическая фиксация: Использовали параформальдегид для сохранения структуры клетки.
- Криофиксация: Робот быстро замораживал образцы, погружая их в жидкий этан.
- Криогенная передача: Образцы переносили в жидкий азот.
- Сублимационная сушка (лиофилизация): Удаляли воду, сохраняя клеточную структуру.
После этого клетки (диаметром всего 12–15 микрон) помещали под микроскоп, чтобы найти и пометить их для целевой визуализации. Для работы на разных установках команда создала стандартные держатели образцов и использовала оптические микроскопы для быстрого поиска клеток, что минимизировало длительное воздействие повреждающего рентгеновского излучения.
Мультимодальные измерения в NSLS-II
Команда использовала две методики визуализации в Национальном источнике синхротронного излучения II (NSLS-II) — пользовательском центре DOE в Брукхейвене:
Рентгеновская компьютерная томография (XCT) на пучковой линии Full Field X-ray Imaging (FXI).
- Показывает физическую структуру клетки в 3D, создавая поперечные сечения (как в медицинском КТ-сканировании).
Рентгеновская флуоресцентная микроскопия (XRF) на пучковой линии Submicron Resolution X-ray Spectroscopy (SRX).
- Высокоэнергетическое рентгеновское излучение возбуждает материал, заставляя его испускать флуоресценцию с уникальным спектром.
- Позволяет определить распределение химических элементов внутри клетки и их биологическую роль.
«Мы были мотивированы объединить XCT и XRF из-за уникальной, взаимодополняющей информации, которую дает каждая методика, — поясняет ведущий ученый FXI Сянхуэй Сяо. — Флуоресценция дает критически важную для биологов информацию о распределении микроэлементов, но получение высокоразрешающей карты для многих клеток может занимать много часов».
3D-изображение, полученное с помощью XCT, помогает направить флуоресцентные измерения в конкретные интересующие области. Это экономит время, увеличивает пропускную способность и сокращает время облучения хрупкого образца.
«Этот коррелятивный подход предоставляет полезную дополнительную информацию для продвижения практических приложений, — отмечает ученый SRX Ян Ян. — Например, при доставке лекарств можно идентифицировать конкретные органеллы и отслеживать перераспределение элементов во время лечения, чтобы понять, как фармацевтические препараты работают на клеточном уровне».
Будущие улучшения и проекты
В рамках проекта NSLS-II Experimental Tools III по созданию новых пучковых линий Ян Ян является научным руководителем команды, работающей над будущей линией Quantitative Cellular Tomography (QCT). Она будет предназначена для биоимиджинга.
QCT — это пучковая линия для полнопольной томографии в мягком рентгеновском диапазоне, которая позволит визуализировать замороженные клетки с нанометровым разрешением без химической фиксации. Эта методика станет дополнением к существующим, предоставляя еще больше деталей о структуре и функциях клеток.
Практическое применение
Эта технология позволяет изучать взаимодействие патогена с клеткой-хозяином, наблюдая структурные изменения до, во время и после заражения. Также можно исследовать взаимодействие полезных бактерий в микробиоме человека или симбиотические грибы с растениями.
Сейчас Цюнь Лю в рамках программы DOE по биологическим и экологическим исследованиям сотрудничает с учеными из других национальных лабораторий и университетов. Они изучают молекулярные взаимодействия между сорго (важной биоэнергетической культурой DOE) и патогенным грибом Colletotrichum sublineola, вызывающим антракноз.
Возможность видеть на таком масштабе дает ученым понимание «войн», которые патогены ведут против сельскохозяйственных культур и человеческого организма. Это помогает разрабатывать инструменты для борьбы с ними или исправления нарушенных систем на фундаментальном уровне. Первый шаг — увидеть мир, невидимый человеческому глазу, и достижения в синхротронной науке оказались для этого мощным инструментом.