Новый инструмент позволяет наблюдать динамику генома в реальном времени
Команда из Стэнфорда под руководством Стэнли Ци и У. Э. Моернера объединила экспертизу в технологиях ДНК и микроскопии сверхвысокого разрешения, чтобы создать инструмент, который может подсветить любую область генома в любой живой клетке и позволить наблюдать, как разные области взаимодействуют друг с другом.
Инструмент, описанный в журнале Cell 15 апреля, может помочь понять, как определённые гены включаются и выключаются как в здоровых клетках, так и при таких заболеваниях, как рак.
Ранее исследователи могли видеть лишь "снимки" взаимодействий ДНК в фиксированных клетках. Новая технология раскрывает четвёртое измерение — время — в живых, динамически меняющихся клетках.
"Наша работа превращает Instagram в YouTube", — сказал Ци.
Особый интерес представляют области ДНК, не содержащие генов. Лишь около 2% из 3 миллиардов единиц нашей ДНК превращаются в белки (процесс экспрессии генов). Остальные 98% раньше называли "мусорной" ДНК, но теперь известно, что эти области содержат важные регуляторные элементы, контролирующие экспрессию генов.
"Они похожи на программное обеспечение, управляющее программой ДНК", — сказал Ци.
Флуоресцентные "почтальоны"
Первый шаг — научиться наблюдать конкретную область генома в сложном "клубке" ДНК. Для этого исследователи использовали версию технологии редактирования генов CRISPR.
Эта версия использует модифицированный белок dCas9 вместе с молекулой РНК, которая служит "почтовым адресом" для конкретного сайта в геноме. Комплекс dCas9-РНК действует как почтальон, находя и прикрепляясь к нужному адресу ДНК, неся при этом флуоресцентную метку.
Чтобы сделать сигнал ярче, исследователи отправляли "стаю" молекулярных почтальонов к уникальным адресам ДНК в одном генетическом "почтовом индексе", подсвечивая нужный участок.
Движения ДНК происходят в масштабе десятков нанометров, что ниже разрешающей способности обычного светового микроскопа. Чтобы преодолеть это ограничение, лаборатория Ци обратилась к экспертизе команды Моернера, которая помогла разработать методы обнаружения света от одиночных флуоресцентных молекул (за что Моернер получил Нобелевскую премию по химии в 2014 году).
Ограничением многих микроскопов была неспособность собирать информацию о движении молекулы сразу во всех трёх измерениях в реальном времени. Моернер и команда использовали оптический трюк в своём микроскопе, чтобы извлекать информацию о положении ДНК сразу в трёх измерениях.
"Мы добавили специальный оптический компонент, который преобразует одно световое пятно в два, так что информация о глубине кодируется в угле между этими двумя пятнами", — объяснил Моернер.
Эти пятна — флуоресцентные "почтальоны", прикреплённые к ДНК. А угол — критически важная недостающая пространственная информация, позволившая захватить полную картину архитектуры ДНК в реальном времени.
Визуализация движения ДНК во время транскрипции
Команда протестировала своих молекулярных "почтальонов", заставив их следить за регуляторными областями ДНК (бывшей "мусорной" ДНК), которые контролируют процесс копирования генов перед превращением в белки — транскрипцию.
Они обнаружили, что во время транскрипции эти регуляторные области ДНК сближались и меньше колебались, как будто общаясь друг с другом.
"Транскрипция сама по себе фундаментальна для биологии, и мы получили это наноразмерное представление так, как у немногих есть возможность его увидеть", — сказал соавтор исследования Ашвин Баладжи.
Поскольку инструмент можно доставить в любую живую клетку, его можно использовать для визуализации геномов первичных клеток — клеток, выделенных непосредственно из тканей, что помогает понять, что происходит в организме.
"Когда мы можем видеть разные участки ДНК в первичных клетках, например, нейронах или иммунных клетках, это меня очень вдохновляет, потому что раньше этого не видели", — сказал первый автор Янью Чжу.
В будущем технология также может использоваться для изучения клеток, полученных непосредственно от пациентов (например, из биопсий опухолей), и может быть особенно ценной для понимания того, как регуляторные области ДНК, не кодирующие гены, способствуют развитию болезней.
"Мы пытаемся узнать секрет 98% 'мусорной' ДНК", — сказал Ци. — "Её больше никто не называет мусором, потому что мы знаем, что она очень важна, но нам всё ещё не хватает информации о том, что она делает, и, что самое важное, какую роль играет в болезни".
Команда Стэнфорда сделала дизайн своего инструмента и алгоритмы анализа свободно доступными для других исследователей. Разработка также велась при содействии третьей лаборатории в Стэнфорде под руководством Эндрю Спаковица, что сделало этот проект по-настоящему междисциплинарным.