Новый метод анализа «тёмной материи» генома
Исследователи из Института молекулярной генетики Макса Планка в Берлине разработали метод, позволяющий детально изучать труднодоступные повторы ДНК. Метод сочетает нанопоровое секвенирование, технологии стволовых клеток и CRISPR-Cas. В будущем он может улучшить диагностику ряда наследственных заболеваний и рака.
Большие участки генома состоят из монотонных областей, где короткие последовательности повторяются сотни или тысячи раз. Экспансия (увеличение числа) этих «повторов ДНК» в определённых местах может иметь серьёзные последствия, как при синдроме ломкой X-хромосомы — одной из наиболее распространённых наследственных причин когнитивных нарушений. Однако эти повторяющиеся регионы до сих пор сложно исследовать даже современными методами.
Команда Франца-Йозефа Мюллера впервые успешно определила длину геномных тандемных повторов в культурах стволовых клеток, полученных от пациентов. Учёные также получили данные об эпигенетическом состоянии повторов, сканируя отдельные молекулы ДНК.
Генетический дефект на X-хромосоме
При синдроме ломкой X-хромосомы экспансия повтора происходит в гене FMR1 на X-хромосоме. Клетка распознаёт повторяющийся регион и «выключает» его, присоединяя метильные группы к ДНК (эпигенетическое изменение). К сожалению, эти метки распространяются на весь ген, что полностью его инактивирует. Этот ген необходим для нормального развития мозга, и его отсутствие приводит к задержкам развития, интеллектуальным нарушениям или аутизму.
Женщины, как правило, меньше страдают от заболевания, так как повтор обычно находится только на одной из двух X-хромосом. Неизменённая вторая копия гена компенсирует дефект. У мужчин же одна X-хромосома, и они проявляют полный спектр симптомов. Этот синдром — одно из примерно 30 заболеваний, вызванных экспансией коротких тандемных повторов.
Первое точное картирование коротких тандемных повторов
В исследовании учёные изучили геном стволовых клеток, полученных из тканей пациентов. Они смогли определить длину повторов и их эпигенетическую сигнатуру, что было невозможно обычными методами секвенирования. Также обнаружилось, что длина повторяющегося региона может сильно варьироваться даже среди клеток одного пациента.
Метод также протестировали на клетках пациентов с экспансией повтора в одном из двух копий гена C9orf72. Эта мутация — одна из наиболее частых моногенных причин лобно-височной деменции и бокового амиотрофического склероза. «Мы впервые картировали всю эпигенетику расширенных и неизменённых повторов в одном эксперименте», — говорит Мюллер. При этом целевой участок ДНК оставался физически нетронутым.
Крошечные поры сканируют отдельные молекулы
«Обычные методы ограничены при работе с высокоповторяющимися последовательностями ДНК и не могут одновременно детектировать их эпигенетические свойства», — говорит Бьёрн Брендль, один из первых авторов работы. Поэтому учёные использовали технологию нанопорового секвенирования. ДНК фрагментируется, и каждая нить проходит через одну из сотен крошечных пор («нанопор») на кремниевом чипе. При этом через поры текут заряженные частицы, создавая ток. Когда молекула ДНК проходит через пору, ток меняется в зависимости от химических свойств ДНК. Колебания электрического сигнала позволяют компьютеру восстановить генетическую последовательность и эпигенетические метки.
Инструменты редактирования генома и биоинформатика освещают «тёмную материю»
Чтобы целенаправленно изучать конкретные регионы, учёные использовали систему CRISPR-Cas для вырезания сегментов ДНК, содержащих повторяющийся регион. Эти сегменты после обработки направлялись в поры секвенирующего чипа.
«Если бы мы не отсортировали молекулы таким образом, их сигнал утонул бы в шуме остального генома», — говорит биоинформатик Пай Гиссельман. Он разработал специальный алгоритм STRique для интерпретации электрических сигналов от повторов: «Большинство алгоритмов дают сбой, так как не ожидают регулярных паттернов повторяющихся последовательностей». Программа не определяет саму генетическую последовательность, но с высокой точностью подсчитывает количество повторов. Она находится в свободном доступе в интернете.
Множество потенциальных применений в науке и клинике
«С системой CRISPR-Cas и нашими алгоритмами мы можем изучать любой участок генома, особенно те регионы, которые сложно исследовать обычными методами», — говорит Мюллер. «Мы создали инструменты, позволяющие каждому исследователю изучать тёмную материю генома».
Метод имеет большой потенциал как для фундаментальных исследований (например, изучения роста повторов во время развития нервной системы), так и для клинической диагностики. Повторяющиеся регионы вовлечены в развитие рака, а новый метод относительно дёшев и быстр. «Мы очень близки к клиническому применению», — заключает Мюллер.