Создание «на-гелевых» альвеолярных органоидов как новой платформы для скрининга
Исследование под руководством профессора Симпэя Гото (Отдел клинического применения) представляет новый метод культивирования для создания альвеолярных органоидов, пригодных для среднего и высокопроизводительного скрининга, и идентифицирует несколько химических соединений с синергетическим эффектом на дифференцировку AT1-клеток. Работа опубликована в журнале Stem Cell Reports.
Альвеолы — функциональные единицы лёгких, где происходит газообмен, — в основном состоят из альвеолярных эпителиальных клеток 1 и 2 типа (AT1 и AT2 соответственно). Помимо выработки сурфактанта, AT2-клетки являются кубоидальными тканевыми стволовыми клетками, которые поддерживают гомеостаз альвеол и регулируют процессы регенерации после повреждения за счёт самообновления и дифференцировки в AT1-клетки.
AT1-клетки — это тонкие и плоские клетки, формирующие большую часть альвеолярной поверхности для обмена кислородом и углекислым газом. Современные знания о сигнальных механизмах дифференцировки AT1 из AT2-клеток основаны в основном на исследованиях на мышах, и остаётся неясным, существуют ли видовые различия в этом процессе.
Исследования традиционно используют первичные человеческие AT2-клетки, но их ограниченное количество сдерживает прогресс. Альтернативно, человеческие iPS-клетки представляют ценный исходный материал для изучения дифференцировки альвеолярного эпителия.
Лаборатория Гото ранее разработала протоколы для получения AT2-клеток из iPS-клеток и создания альвеолярных органоидов из iPS-клеток пациентов для моделирования заболеваний. Однако такие органоиды не оптимальны для скрининга, так как требуют большого количества клеток и полностью погружены в Matrigel — субстрат, имитирующий внеклеточную среду.
В данном исследовании учёные создали новую дуальную репортёрную iPS-линию для мониторинга дифференцировки AT1-клеток и разработали новый метод культивирования «на-гелевых» альвеолярных органоидов, высевая клетки-предшественники лёгких или AT2-клетки, полученные из iPS-клеток, поверх Matrigel в 96-луночных планшетах.
Хотя другие маркеры AT2 показывали схожую экспрессию при этом методе, AT2-клетки в полученных сфероидах экспрессировали значительно более высокие уровни сурфактантного белка C, чем органоиды, созданные по старым протоколам. Напротив, множественные маркеры AT1-клеток обнаруживались на более низких уровнях в «на-гелевых» сфероидах, что указывало на их отсутствие или незрелость.
Транскриптомный анализ подтвердил более AT2-доминантный состав этих сфероидов. При этом AT2-клетки в сфероидах проявляли структурные характеристики, свойственные функциональным AT2-клеткам.
В целом, новый метод «на-гелевого» культивирования, требующий малого числа клеток и более простой в обращении, оказался оптимальным для скрининга потенциальных индукторов дифференцировки AT1.
В качестве доказательства концепции команда провела среднемасштабный химический скрининг 274 соединений на клетках-предшественниках лёгких, выращенных новым методом, и обнаружила 15 химических соединений, значительно повысивших уровень AT1-специфичного репортёра.
Они проверили эти кандидаты, оценив их способность усиливать экспрессию AT1-специфичных генов AGER, CLIC5 и CAV1.
Среди них LATS-IN-1 и ROCK-IN-2 (известные как ингибиторы LATS1/2 и ROCK2 соответственно) значительно повышали экспрессию этих генов-маркеров AT1. Помимо того, что ингибирование LATS1/2 способствовало дифференцировке AT1 через активацию сигнального пути YAP/TAZ, учёные также обнаружили, что ROCK-IN-2 индуцирует экспрессию генов, связанных с YAP/TAZ. Однако оба соединения вызывали слипание сфероидов и стимулировали пролиферацию — свойства, противоположные AT1-клеткам (тонкие, плоские, покоящиеся клетки).
Тестирование других ингибиторов ROCK2 не показало стимуляции дифференцировки AT1, что позволяет предположить, что эффект ROCK-IN-2, вероятно, обусловлен побочным действием на путь YAP/TAZ.
Четыре других кандидатных соединения показали промежуточный эффект на экспрессию генов-маркеров AT1 и были протестированы на синергетический эффект в комбинации с LATS-IN-1 для активации сигналинга YAP/TAZ. BAY1125976, аллостерический ингибитор AKT, синергетически усиливал экспрессию AT1-генов в комбинации с LATS-IN-1.
При валидации также наблюдались синергетические эффекты между LATS-IN-1 и двумя другими ингибиторами PI3K/AKT — Alpelisib и AZD6482.
Аналогичные результаты были получены при обработке независимой линии человеческих iPS-клеток или первичных AT2-клеток той же химической комбинацией. Дополнительные транскриптомные, морфологические и функциональные анализы последовательно показали, что сочетанное применение LATS-IN-1 и BAY1125976 способствует клеточным изменениям в сторону AT1-подобного фенотипа.
Создав новую дуальную репортёрную iPS-линию для мониторинга дифференцировки AT1 и установив новый метод культивирования «на-гелевых» сфероидов, совместимый с высокопроизводительным скринингом, данная работа идентифицировала химические модуляторы путей YAP/TAZ и AKT как мощную индуцирующую смесь для дифференцировки AT1-клеток.
Благодаря возможности адаптировать «на-гелевые» культуры сфероидов для высокопроизводительного химического или CRISPR/Cas-генетического скрининга, инновации этого исследования помогут совершить следующий прорыв в регенеративной пульмонологии.