Учёные раскрыли, как фосфат покидает актиновые филаменты

Актиновые филаменты — это динамичные белковые волокна в клетке, построенные из отдельных актиновых белков. Многие клеточные функции, включая движение клетки, регулируются постоянной сборкой и разборкой филаментов. Фаза разборки инициируется высвобождением фосфатной группы изнутри филамента, но детали этого процесса десятилетиями оставались загадкой для учёных.

Исследователи из Института молекулярной физиологии Макса Планка в Дортмунде и Института биофизики Макса Планка во Франкфурте объединили усилия, чтобы точно идентифицировать область в актине, которая функционирует как «молекулярная чёрная дверь» для выхода фосфата. Результаты опубликованы в журнале Nature Structural & Molecular Biology.

Используя широкий спектр методов, включая криогенную электронную микроскопию (cryo-EM) и молекулярно-динамическое моделирование, учёные определили механизм высвобождения фосфата из актиновых филаментов с беспрецедентной молекулярной детализацией. Они также описали, как деформированная «чёрная дверь» обеспечивает более быстрое высвобождение фосфата у мутантного актина, связанного с немалиновой миопатией — тяжёлым мышечным заболеванием. Исследование открывает путь для дальнейшего изучения динамического цикла сборки актина в клетках и заболеваний, связанных с дефектной организацией актина.

Таинственный побег фосфата

В эукариотических клетках актиновые белки соединяются (полимеризуются) в филаменты, которые являются частью сложной опорной сети клетки — цитоскелета. Разборка старых филаментов критически важна для движения клетки и регулируется гидролизом АТФ — реакцией АТФ с водой, которая расщепляет фосфатную группу и генерирует энергию.

В частности, высвобождение фосфата из сердцевины филамента является сигналом для клетки о том, что актиновый филамент достаточно «стар» и может быть разобран на субъединицы актина. «Механизм высвобождения фосфата из актиновых филаментов оставался загадкой на протяжении десятилетий», — говорит Ваут Остерхирт, постдок в группе Стефана Раунзера в MPI Дортмунд и первый автор публикации.

Новые результаты основаны на предыдущих исследованиях группы Раунзера по актину, которые привели к основополагающим публикациям в этой области в 2015, 2018 и 2022 годах. В последней из них команда Раунзера определила высокоразрешающие крио-ЭМ структуры актиновых филаментов в трёх различных состояниях: связанных с АТФ, связанных с АДФ в присутствии расщеплённого фосфата и связанных с АДФ после высвобождения фосфата.

Однако во всех структурах не было обнаружено отверстия или «двери» в актине, через которую фосфат мог бы покинуть филамент. «Поэтому мы предположили, что должна существовать «чёрная дверь», которая на мгновение открывается, чтобы выпустить фосфат, а затем быстро закрывается снова», — говорит Раунзер.

Мультидисциплинарный подход

Учёные MPI подошли к проблеме с разных сторон. Поскольку было известно, что фосфат очень быстро высвобождается из актина на кончике филамента (так называемом заострённом конце, barbed end), команда Раунзера определила его структуру с помощью cryo-EM. И действительно, только на конце филамента они обнаружили открытую молекулярную «чёрную дверь», что объясняет очень быстрое высвобождение фосфата. Однако оставалось неясным, как фосфат покидает субъединицы актина в сердцевине филамента.

Здесь пригодился опыт группы Герхарда Хаммера из MPI Франкфурт; они использовали структурные данные 2022 года для проведения молекулярно-динамического моделирования и предсказания потенциальных путей выхода фосфата из сердцевины филамента. Затем они объединились с группой Петера Биелинга (MPI Дортмунд), чтобы проверить возможные пути, создав мутантные формы актина, потенциально нарушающие молекулярную «чёрную дверь». Они измерили, как быстро эти мутанты высвобождают фосфат, и, наконец, определили высокоразрешающие крио-ЭМ структуры «самых быстрых» кандидатов.

Мутационный анализ показал, что фосфат использует один и тот же путь выхода как на конце филамента, так и в его сердцевине. Однако структуры и взаимодействия в сердцевине требуют дополнительных перестроек, которые затрудняют открытие «двери». После расщепления фосфата «чёрная дверь» остаётся преимущественно закрытой (в среднем 100 секунд), прежде чем открыться менее чем на секунду, чтобы выпустить фосфат. «Это объясняет, почему мы не видели открытой «двери» в наших крио-ЭМ данных 2022 года», — говорит Раунзер.

Один из проанализированных мутантов актина, называемый N111S, связан с мышечным заболеванием — немалиновой миопатией, что привлекло внимание учёных MPI: у мутанта «чёрная дверь» всегда находится в открытом состоянии, и поэтому он высвобождает фосфат намного быстрее, чем нормальный актин дикого типа. «Мы предполагаем, что это сверхбыстрое высвобождение может способствовать патофизиологии у пациентов с этой мутацией актина», — говорит Остерхирт.

В качестве следующего шага учёные MPI хотят выяснить, как высвобождение фосфата контролируется внутри клетки и какую роль играют белки, связывающиеся с актином. Кроме того, их работа теперь позволяет исследовать другие связанные с заболеваниями мутации в актине — подход, который в конечном итоге может способствовать разработке новых терапевтических стратегий для этих болезней.