Редактирование бактерий CRISPR: меньше — лучше
Систематическое снижение активности нацеливания на ДНК позволяет достичь CRISPR-редактирования в бактериях, значительно увеличивая количество колоний и даже повышая частоту точного редактирования генома. Это показало исследование Вюрцбургского института Гельмгольца (HIRI) в сотрудничестве с Центром Гельмгольца по исследованию инфекций (HZI) в Брауншвейге. Результаты опубликованы в журнале Nature Communications.
Преодоление ключевого препятствия
"CRISPR-редактирование генома стало распространённой молекулярной технологией, но существует серьёзное препятствие", — говорит руководитель исследования Чейз Байзел из HIRI. — "Во время экспоненциального роста бактерии инициируют репликацию генома несколько раз за один клеточный цикл. Эффективное разрезание ДНК CRISPR приводит к преждевременной гибели клетки. Следовательно, редактирование требует эффективной рекомбинации и высокой трансформационной эффективности, которые недоступны для большинства бактериальных штаммов".
Кажущийся парадоксальным подход
"Мы обнаружили, что ослабление режущей активности CRISPR позволит клетке восстановить разрезанную ДНК с использованием предоставленной матрицы для гомологичной рекомбинации. В результате мы смогли стимулировать гомологичную рекомбинацию и получить гораздо больше выживших клеток", — объясняет первый автор исследования Дафна Коллиас.
Исследователи разработали набор подходов для снижения активности:
- Использование разных форматов гидовой РНК (guide RNA), направляющей разрезание белком Cas9
- Применение версий Cas9 с пониженной эффективностью разрезания
- Снижение экспрессии гидовой РНК
- Введение мешающих структур в гидовую РНК
- Мутирование последовательности в гидовой РНК, используемой для поиска цели в ДНК
Модифицированные гидовые РНК были названы "ослабленными гидовыми РНК" (attenuated guide RNAs или atgRNAs).
Практическое применение и перспективы
В качестве доказательства концепции лаборатория Байзела совместно с лабораторией Тиля Штроивига из HZI улучшила редактирование в различных штаммах бактерий Klebsiella. Используя мультирезистентный штамм, они применили редактирование для отмены устойчивости к антибиотику ампициллину.
Новый подход к редактированию может продвинуть фундаментальные исследования бактерий, влияющих на здоровье человека. Отредактированные бактерии также могут в будущем использоваться в качестве терапевтических пробиотиков или продуцентов терапевтических средств.