Чтение правил регуляции генов с помощью CRISPR

Мы едва начали раскрывать книгу правил для обширных некодирующих областей генома. Два новых метода, основанных на достижениях CRISPR, могут помочь прочитать некоторые её страницы.

У нас есть достаточно хорошее понимание правил, стоящих за кодирующими белок компонентами генома. Мы можем посмотреть на последовательность ДНК и с уверенностью указать, где начинается кодирующая область гена, где она заканчивается, и определить её структуру.

Для оставшихся 98% генома — части, которая диктует, какие гены считывает клетка, — история иная. Наши знания о правилах, управляющих этой «тёмной материей», получены путём изучения и манипулирования отдельными участками некодирующей ДНК по одному. Книга правил, объясняющая, как работает некодирующий геном, однако, оставалась недоступной.

«Девяносто процентов генетических вариаций, влияющих на болезни человека, находятся в некодирующих областях», — сказал основатель и директор Broad Institute Эрик Ландер. — «Но у нас не было систематического способа определить, какие регуляторы влияют на какие гены».

В двух недавно опубликованных статьях в Science две исследовательские группы из Broad Institute показывают, как методы, использующие редактирование генов CRISPR, могут помочь понять эти правила.

Используя два взаимодополняющих подхода, команды — одна из лаборатории Ландера, другая из лаборатории члена Broad Institute и исследователя McGovern Institute for Brain Research Фэн Чжана — использовали CRISPR как инструмент для систематического одновременного исследования тысяч последовательностей некодирующей ДНК (подобно тому, как группы из Broad делали это ранее с кодирующей ДНК). В процессе обе идентифицировали несколько интересных генетических регуляторов, включая те, что находятся в миллионах пар оснований от контролируемых ими генов.

«Мы хотели бы иметь возможность каталогизировать некодирующие элементы, которые контролируют экспрессию каждого гена в каждом типе клеток», — сказал Джесси Энгрейц, постдок из лаборатории Ландера и старший автор одной из статей. — «Это масштабная проблема в биологии, и это лимитирующий шаг для связи многих генетических ассоциаций с их фундаментальными молекулярными механизмами и с болезнями человека».

Вариации на тему

Обе команды использовали пул-скрининги CRISPR (которые одновременно сканируют и редактируют большие участки генома с помощью молекулярного скальпеля — фермента Cas9 и тысяч направляющих РНК, которые нацеливают Cas9 на определённые последовательности), чтобы нарушить работу некодирующей ДНК. Но они сделали это по-разному.

Чжан, Невилл Саньяна (бывший сотрудник лаборатории Чжана, а ныне ключевой член New York Genome Center) и Джейсон Райт (также бывший сотрудник Чжана, ныне в Homology Medicines) использовали Cas9 для внесения точных изменений в перекрывающиеся участки некодирующей ДНК — в их случае, в областях вокруг трёх генов (NF1, NF2 и CUL3), потеря функции которых связана с лекарственной устойчивостью при одной из форм меланомы.

«Этот подход позволяет нам индуцировать широкое разнообразие мутаций», — пояснил Саньяна. — «Нам не нужно гадать, как лучше всего нарушить данную последовательность».

Энгрейц, Ландер и аспирант Чарльз Фулько, с другой стороны, использовали систему CRISPR-интерференции, применяя неактивную или «мёртвую» форму Cas9, слитую с белковым фрагментом под названием KRAB-домен, чтобы «заглушить» целевые последовательности (вокруг MYC и GATA1, генов двух важных транскрипционных факторов).

«Эта система даёт хорошую количественную оценку регуляторного влияния данного некодирующего региона», — сказал Энгрейц. — «Она одновременно показывает, где находятся регуляторные элементы, контролирующие данный ген, и говорит, насколько важен каждый из них».

Затем каждая команда использовала функциональный показатель (повышенная лекарственная устойчивость клеток меланомы у Саньяны, Райта и Чжана; снижение роста клеток у Фулько, Ландера и Энгрейца) и глубокое секвенирование, чтобы увидеть, какие из их направляющих РНК повлияли на экспрессию интересующих их генов, и картировать регуляторы, на которые воздействовали эти РНК.

Результаты обеих команд, подтверждённые рядом дополнительных методов (например, профилирование хроматина, захват 3D-конформации, профилирование транскрипционных факторов), указывают на потенциал использования инструментов CRISPR для отслеживания регуляторных связей некодирующего генома. Фулько, Ландер и Энгрейц обнаружили и ранжировали по относительной важности семь энхансеров MYC и три энхансера GATA1 (короткие фрагменты некодирующей ДНК, повышающие вероятность считывания гена). Скрининг Саньяны, Райта и Чжана выявил множество энхансеров и сайтов связывания транскрипционных факторов только для одного гена CUL3.

Изучение последовательностей в их естественной среде

Хотя по принципу схожие с традиционными репортёрными анализами (где учёные соединяют интересные последовательности с репортёрными генами в плазмидах), эти пул-скрининги CRISPR имеют ключевое отличие: они исследуют последовательности напрямую, в их естественной среде обитания.

«Скрининги исследуют последовательности в их эндогенном контексте», — подчеркнул Саньяна. — «Репортёрные анализы могут быть очень полезны, но им не хватает 3D-конформации или локальной хроматиновой среды нативного геномного контекста. Здесь регуляторные последовательности проходят все свои обычные взаимодействия».

«Например, мы могли видеть дальнодействующие петли между промоторами генов и некодирующими сайтами за тысячи пар оснований», — продолжил он. — «Мы полностью упустили бы эти интересные 3D-взаимодействия, если бы просто рассматривали эти регуляторные элементы изолированно».

Одно ограничение, отметил Энгрейц, заключается в том, что ни один из подходов CRISPR в его нынешней форме не учитывает присущую геному избыточность. «Возможно, недостаточно нарушить один энхансер, чтобы по-настоящему понять, как контролируется ген. Возможно, нужно нарушить более одного», — сказал он. — «Мы пока не можем этого сделать».

Но Энгрейц, Саньяна и Ландер настроены оптимистично относительно потенциала использования подходов на основе CRISPR для раскрытия внутренней логики некодирующего генома.

«Одна интересная проблема с некодирующим геномом заключается в том, что, хотя он огромен, отдельные функциональные элементы внутри него могут быть довольно маленькими», — сказал Саньяна. — «В будущем будет важно подумать о том, как мы можем разработать новые подходы, которые исследуют более крупные регионы, сохраняя при этом высокое разрешение».

Энгрейц согласился, добавив: «Есть вероятность, что по мере картирования большего количества этих связей мы узнаем правила, которые позволят нам предсказывать их для остальной части некодирующего генома».

«Эти подходы, использующие библиотеки направляющих РНК, чтобы с помощью CRISPR разрезать или доставлять ингибиторы, позволяют напрямую увидеть эффекты больших областей некодирующей ДНК на разные гены», — сказал Ландер. — «Я думаю, это раскроет систематические карты регуляции генов».