Исследование раскрывает структуру ключевого комплекса CRISPR

Исследователи из MIT, используя систему редактирования генов CRISPR/Cas9, изначально разработанную для удаления генов, показали, что могут надежно включать любой выбранный ген в живых клетках.

Это новое применение системы CRISPR/Cas9 позволит ученым легче определять функцию отдельных генов. Подход также позволяет проводить быстрые функциональные скрининги всего генома для выявления генов, вовлеченных в определенные заболевания. В исследовании, опубликованном 10 декабря в онлайн-издании Nature, были идентифицированы гены, помогающие клеткам меланомы стать устойчивыми к противораковому препарату.

Новая функция для CRISPR

Ранее CRISPR использовали для выключения или замены генов. В новом исследовании система Cas9 была модифицирована для включения генов. Предыдущие попытки, основанные на присоединении активационных доменов к концам белка Cas9, были неустойчивыми.

Проанализировав 3D-структуру комплекса Cas9, связанного с направляющей РНК и целевой ДНК, исследователи решили присоединить активационные домены к двум небольшим петлям направляющей РНК, которые выступают из комплекса Cas9. Это обеспечило гибкость для рекрутирования транскрипционного аппарата.

Усовершенствованная система активировала около дюжины генов, которые было трудно или невозможно включить с помощью предыдущих активаторов Cas9. Транскрипция усилилась как минимум в два раза, а для многих генов — на несколько порядков.

Скрининг активации в масштабе генома

Исследователи создали библиотеку из 70 290 направляющих РНК, нацеленных на все более чем 20 000 генов человеческого генома. Эту библиотеку использовали для скрининга генов, обеспечивающих устойчивость к препарату от меланомы PLX-4720.

Препараты этого типа эффективны против клеток меланомы с мутацией в гене BRAF, но выжившие после лечения клетки могут привести к рецидиву. Для выявления генов устойчивости компоненты CRISPR доставили в большую популяцию клеток меланомы, где каждая клетка получила уникальную направляющую РНК. После обработки PLX-4720 были идентифицированы гены, помогающие клеткам выжить, включая как известные, так и новые мишени.

Подобные скрининги могут помочь в открытии новых препаратов, предотвращающих развитие устойчивости опухолей, за счет комбинированной терапии, нацеленной одновременно на мутантный BRAF и гены выживания клеток.

Технику также планируют использовать для скрининга генов, активация которых может скорректировать эффекты аутизма или нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Необходимые реагенты будут доступны для академических лабораторий через репозиторий Addgene.