Новое пополнение CRISPR-инструментария: Учим генетические ножницы детектировать РНК
CRISPR-Cas системы, защитные системы бактерий, стали богатым источником технологий для молекулярной диагностики. Исследователи из Института РНК-инфекционных исследований Гельмгольца (HIRI) в Вюрцбурге расширили этот обширный инструментарий. Их новый метод, названный PUMA, позволяет детектировать РНК с помощью нуклеаз Cas12, которые по своей природе нацелены на ДНК. PUMA обещает широкий спектр применений и высокую точность.
Результаты опубликованы в журнале Nature Communications.
От LEOPARD к PUMA
Диагностическая платформа LEOPARD, разработанная лабораторией Чейза Байзела в 2021 году, использует CRISPR-технологию на основе Cas9. Однако CRISPR-Cas системы включают и другой разнообразный набор нуклеаз — Cas12.
«LEOPARD был сосредоточен на Cas9. Однако CRISPR-Cas системы также включают другой разнообразный набор нуклеаз, называемых Cas12», — объясняет Чейз Байзел.
В то время как и Cas9, и Cas12 разрезают ДНК-мишени, Cas12 может усиливать выходной сигнал, выполняя разрезы на «побочной» ДНК. Это может сделать диагностические технологии более чувствительными и эффективными.
Команда под руководством Чейза Байзела расширила уникальные особенности LEOPARD на Cas12. Получившийся метод назвали PUMA (Programmable tracrRNAs Unlock protospacer-adjacent Motif-independent detection of ribonucleic Acids by Cas12 nucleases).
Преодоление ограничений
Два основных ограничения Cas12-технологий сохранялись:
- Они были ограничены ДНК-мишенями.
- Для идентификации молекулы-мишени требовалась специфическая последовательность распознавания — PAM (protospacer-adjacent motif).
PUMA элегантно решает эти проблемы. Как и LEOPARD, этот новый метод также полагается на tracrRNA.
«Используя PUMA, мы можем перепрограммировать tracrRNA. Это позволяет нам решать, какая РНК-биомаркер станет гидовой РНК. Эта гидовая РНК, в свою очередь, направляет Cas12 на предоставленную нами молекулу ДНК и активирует генетические ножницы», — объясняет первый автор исследования Чуньлэй Цзяо.
Разрезание ДНК затем сообщает нам, какой биомаркер присутствовал в образце, например, биомаркеры, специфичные для разных патогенов.
Ключевые особенности PUMA
- Детекция РНК с помощью Cas12: Метод позволяет обнаруживать РНК-биомаркеры с помощью CRISPR-нуклеаз, которые в норме распознают только ДНК. Это особенно важно для молекулярных биомаркеров, которые можно найти только на уровне РНК, например, РНК-вирусов.
- Независимость от PAM: PAM содержится в предоставляемой молекуле ДНК-мишени. Поскольку исследователи предоставляют мишень, они могут вводить усеченную ДНК, что позволило значительно увеличить скорость метода.
Потенциал и применение
Команда продемонстрировала потенциал метода, идентифицировав пять бактериальных патогенов, связанных с острой септицемией. Их детекция полагалась на единую универсальную, перепрограммированную tracrRNA, что обеспечивает упрощенное средство дифференциации различных типов бактерий.
«Новая технология представляет собой новую форму CRISPR-диагностики, которая позволяет проводить надежное молекулярное тестирование в месте оказания помощи — будь то идентификация вирусных или бактериальных патогенов или обнаружение онкологических биомаркеров», — говорит Цзяо.
Исследователи уже планируют следующие шаги: «Наша цель — достичь мультиплексного считывания, аналогичного LEOPARD, и расширить спектр применений технологии», — говорит Байзел, который также ожидает широкого использования в научном сообществе.