Новые инструменты для быстрой идентификации PAM-последовательностей CRISPR-Cas систем

CRISPR-Cas системы широко известны как новое поколение генетических инструментов. Однако их разработка требует от исследователей идентификации протоспейсер-смежных мотивов (PAM), которые "открывают" функциональность каждой системы. Новый набор методов ускоряет идентификацию PAM — и первые тесты показывают, что многие CRISPR-Cas системы на самом деле имеют несколько PAM разной силы.

PAM — это короткие генетические последовательности, прилегающие к целевой ДНК вирусов или других захватчиков. Когда белок в CRISPR-Cas системе идентифицирует PAM, это заставляет его связаться с этой ДНК и начать сравнение соседней последовательности ДНК с CRISPR РНК. Если ДНК и РНК совпадают, белок разрезает целевую ДНК.

"Чтобы исследователи могли использовать CRISPR-Cas систему для редактирования генов, регуляции генов или других методов, сначала необходимо определить соответствующие PAM-последовательности, которые запускают эту конкретную комбинацию CRISPR-белка", — говорит Чейз Байзел, старший автор работы.

Проблема в том, что сложно предсказать, какие генетические последовательности функционируют как PAM для данной CRISPR-Cas системы. Эти последовательности сильно различаются даже у близкородственных систем. Например, PAM, запускающий белок Cas9 из Streptococcus pyogenes, состоит всего из трех нуклеотидов, а PAM для Cas9 из Staphylococcus aureus содержит шесть нуклеотидов — и они не перекрываются.

Инструмент PAM-SCANR

Для решения этой задачи был разработан инструмент PAM-SCANR, который позволяет идентифицировать PAM-последовательности для любой заданной комбинации CRISPR-белка.

Как это работает:

  1. Исследователи берут CRISPR-Cas систему, для которой нужно найти PAM.
  2. Соответствующая пара CRISPR-белок используется в качестве активного агента в высокопроизводительном скрининге, где она одновременно подвергается воздействию множества различных генетических последовательностей.
  3. Эти последовательности являются частью генетической конструкции, сконструированной так, чтобы "загораться" (флуоресцировать), когда пара CRISPR-белок связывается с ними. Это может произойти только при наличии функционального PAM.

"Этот инструмент уникален тем, что его можно использовать для скрининга и идентификации PAM в широком спектре CRISPR-Cas систем", — говорит Райан Линей, ведущий автор статьи.

Исследователи протестировали PAM-SCANR на пяти CRISPR-Cas системах, относящихся к трем из четырех известных типов CRISPR, которые для функционирования зависят от PAM.

Неожиданное открытие: множественные PAM

Также был разработан инструмент PAM wheel, который помогает визуализировать результаты скрининга PAM-SCANR и показывает, насколько одни PAM лучше других.

Это важно, потому что при тестировании PAM-SCANR исследователи обнаружили, что для данной CRISPR-Cas системы может быть несколько PAM — что стало неожиданностью — и что некоторые PAM запускают гораздо более сильный ответ, чем другие.

"Когда мы впервые обнаружили PAM почти десять лет назад, мы изначально думали, что работает только один PAM", — говорит Родольф Баррангу, старший автор работы. — "Однако наши инструменты показали, что для одной CRISPR-Cas системы может быть несколько PAM, и некоторые из них явно работали лучше других".

Дальнейшие шаги

Исследователи уже используют PAM-SCANR для идентификации PAM в CRISPR-Cas системах, которые могут стать следующим поколением CRISPR-инструментов. Они также работают над тем, чтобы определить, как разные PAM для конкретной системы могут влиять на её эффективность в различных приложениях.

"Например, мы хотим знать, имеет ли вариабельность среди PAM последствия для редактирования генома и нашей способности предсказывать сайты нецелевого воздействия — места, которые CRISPR-Cas система может атаковать помимо целевой ДНК", — говорит Чейз Байзел.