Цитозиновые редакторы оснований вызывают неожиданные мутации по всему геному
Китайские учёные обнаружили, что цитозиновые редакторы оснований (BE3 и HF1-BE3) индуцируют нецелевые мутации по всему геному.
Исследовательская группа под руководством профессора Гао Цайся из Института генетики и биологии развития Китайской академии наук провела всестороннее исследование нецелевых мутаций BE3, HF1-BE3 и ABE с помощью полногеномного секвенирования (WGS) на рисе — важной сельскохозяйственной культуре.
Редакторы оснований (CBE и ABE) представляют собой гибриды никаза-белка Cas9 с цитозиновой или адениновой деаминазой и катализируют конверсию C>T или A>G в сайте-мишени направляющей РНК (sgRNA).
Хотя целевые конверсии CBE и ABE были обнаружены во многих организмах, их нецелевые эффекты не были систематически оценены на уровне всего генома.
Исследователи выбрали три широко используемых редактора: BE3, высокоточный BE3 (HF1-BE3) и ABE. Всего 14 конструкций редакторов, нацеленных на 11 геномных сайтов, были трансформированы в рис с помощью Agrobacterium.
Регенерированные растения T0, отредактированные BE3, HF1-BE3 или ABE, и растения, трансформированные редакторами, но без sgRNA, вместе с двумя контрольными группами были проанализированы с помощью WGS.
Группы редакторов и контроля существенно не различались по количеству инделей. В отличие от этого, группы BE3 и HF1-BE3 имели значительно больше однонуклеотидных вариантов (SNV), чем группы ABE и контроля.
Среднее количество C>T SNV на растение составило:
- 203 (BE3)
- 347 (HF1-BE3)
- 88 (ABE)
- 105 (контроль)
Таким образом, C>T SNV у растений BE3 и HF1-BE3 встречались на 94,5% и 231,9% чаще, чем у контрольных растений соответственно.
Примечательно, что обработка растений риса BE3 и HF1-BE3 даже в отсутствие sgRNA также вызывала большое количество C>T SNV. Более того, подавляющее большинство дополнительных C>T мутаций, вызванных BE3 и HF1-BE3, не совпадало с нецелевыми сайтами, предсказанными с помощью in silico программы (Cas-OFFinder).
Все SNV, а также C>T SNV, были распределены по всему геному риса, что указывает на их общегеномный характер. Сопоставление с данными транскриптома показало, что высокое количество C>T SNV, связанных с BE3 и HF1-BE3, чаще происходило в транскрибируемых генных областях, где одноцепочечная ДНК образуется из-за активной транскрипции.
В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что BE3 и HF1-BE3, но не ABE, индуцируют общегеномные нецелевые мутации в рисе. Эти мутации, в основном C>T SNV и обогащённые в транскрибируемых генных областях, не предсказываются текущим in silico подходом. Вероятно, именно модуль конверсии оснований, содержащий цитозиновую деаминазу, ответственен за большое количество нецелевых SNV, вызываемых BE3 и HF1-BE3, и нуждается в оптимизации для повышения специфичности цитозиновых редакторов.
«Редакторы оснований представляют собой привлекательный инструмент для создания точных генетических вариантов, необходимых в селекции растений. Специфичность этих редакторов имеет первостепенное значение, поскольку нецелевые мутации могут быть вредными. Мы показали, что текущие BE3 или HF1-BE3 вызывают неожиданные и непредсказуемые общегеномные нецелевые мутации у растений, что подчёркивает необходимость оптимизации специфичности этого типа редакторов», — сказал доктор Гао.
Работа под названием «Цитозиновые, но не адениновые, редакторы оснований индуцируют общегеномные нецелевые мутации в рисе» будет опубликована в журнале Science.