Новый метод безопасного введения молекул в клетки

Профессор Кевин Браекманс из Гентского университета в течение последних 10 лет работал над методом безопасного инжиниринга терапевтических клеток с помощью фототермальных нановолокон. Nature Nanotechnology публикует исследование, показывающее, как были разработаны эти биосовместимые нановолокна. При лазерном облучении клетки, контактирующие с ними, становятся проницаемыми и могут быть трансфицированы различными эффекторными молекулами, включая рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas9 и siRNA. Команда профессора Браекманса продемонстрировала, что клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки и человеческие T-клетки, трансфицированные с помощью таких нановолокон, сохраняют отличное состояние и свою терапевтическую функциональность.

Новая основа для клеточных терапий

Клеточные терапии — это новая форма лечения, при которой генетически модифицированные клетки вводятся пациенту для профилактики или лечения заболеваний. Известный пример — использование собственных иммунных клеток пациента с раком, которые можно выделить, генетически модифицировать и размножить в лаборатории, а затем вернуть в организм для атаки опухолевых клеток. Генетическая модификация клеток зависит от технологий внутриклеточной доставки, которые часто не могут обеспечить достаточную эффективность при минимальном воздействии на здоровье и функционирование клетки.

Фотопорация, сенсибилизированная наночастицами, особенно перспективна, так как обычно обеспечивает высокую эффективность, пропускную способность и низкую токсичность. Она основана на использовании светочувствительных наночастиц, например, золотых наночастиц (NPs), которые при импульсном лазерном облучении могут образовывать взрывные нанопузырьки. Эти крошечные взрывы могут создавать небольшие поры в клеточных мембранах, позволяя внешним эффекторным молекулам, добавленным в среду, проникать внутрь клеток. Однако переход к клиническому применению фотопорации, сенсибилизированной наночастицами, затруднён из-за контакта клеток с (неразлагаемыми) наночастицами, что вызывает токсикологические и регуляторные проблемы.

Поэтому необходим новый подход, сохраняющий преимущества фотопорации с наночастицами, но исключающий прямой контакт клеток с ними. Команда профессора Браекманса внедрила фототермальные наночастицы оксида железа (IONPs) в биосовместимые полимерные нановолокна, созданные методом электроспиннинга. Поликапролактон (PCL) — это биосовместимый полимер, широко используемый в биомедицинских приложениях, а IONPs — экономичны и имеют широкий спектр поглощения света.

Исследователи показали, что как адгезивные, так и суспензионные клетки можно безопасно и эффективно трансфицировать различными макромолекулами при облучении наносекундными лазерными импульсами. Элементный анализ с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS/MS) подтвердил, что IONPs остаются надёжно внедрёнными в нановолокна после лазерного облучения, поэтому обработанные клетки фактически не подвергаются прямому воздействию наночастиц. Для лучшего понимания влияния энергии лазерного импульса, распределения и состояния агрегации IONPs на проницаемость клеточной мембраны были проведены численные моделирования теплопередачи от внедрённых в волокна IONPs к соседним клеткам.

Экспериментально команда показала, что фотопорация с фототермальными нановолокнами может успешно доставлять функциональные биологические молекулы, включая siRNA или рибонуклеопротеины CRISPR-Cas9 (RNPs), как в адгезивные, так и в суспензионные клетки, включая человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESC) и первичные человеческие T-клетки. В качестве эталона было проведено сравнение с современным методом электропорации. В то время как электропорированные клетки демонстрировали изменения фенотипа и функциональности, фотопорированные клетки сохраняли способность к пролиферации и, в случае CAR-T клеток, к уничтожению опухолевых клеток. Наконец, метод PEN-фотопорации был использован для трансфекции CAR-T клеток siRNA, нацеленной на рецептор PD1 — известный ингибитор иммунных контрольных точек. Было подтверждено, что клетки, обработанные siPD1, обладают повышенной способностью уничтожать опухоль in vivo.

В совокупности это показывает, что фотопорация с фототермальными нановолокнами позволяет эффективно и безопасно осуществлять внутриклеточную доставку широкого спектра эффекторных молекул в различные типы клеток без контакта с потенциально токсичными фототермальными наночастицами. «Мы считаем, что это важный шаг на пути к использованию фотопорации для безопасного и эффективного производства генетически модифицированных клеточных терапий», — говорит профессор Браекманс.