Исследователи выяснили, как гибкость белкового шарнира важна для переноса клеточных белков

Убиквитинирование — присоединение белка убиквитина — ключевой этап многих клеточных процессов, таких как деградация белков, репарация ДНК и передача сигналов. Используя высокоскоростную атомно-силовую микроскопию (HS-AFM) и молекулярное моделирование, исследователи под руководством Хироки Конно и Хольгера Флексига из WPI-NanoLSI Университета Канадзавы определили, как подвижность шарнира фермента, связанного с убиквитинированием, позволяет этому процессу происходить.

Известно, что убиквитинирование облегчают несколько ферментов: активирующий убиквитин фермент (E1), конъюгирующий фермент (E2) и лигаза (E3), катализирующая присоединение убиквитина к белку-мишени.

Лигаза типа HECT (E3) характеризуется наличием HECT-домена, который состоит из N-доли (с сайтом связывания E2) и C-доли (с каталитическим остатком Cys). Две доли соединяет гибкий шарнир, что привело к гипотезе: убиквитинирование облегчается перестройкой белка вокруг этого шарнира.

Конно и коллеги использовали высокоскоростной атомно-силовой микроскоп для поиска доказательств этой гипотезы. Исследование опубликовано в журнале Nano Letters.

Учёные отметили, что при кристаллизации HECT-домена с ферментом типа E2 он образует L-образную форму, при которой расстояние между каталитическим остатком Cys HECT-домена и каталитическим Cys фермента E2 составляет 41 Å — слишком много для переноса убиквитина. Однако в каталитической конформации HECT-домен имеет другую форму, где расстояние между двумя каталитическими остатками Cys намного меньше — всего 8 Å, поэтому она считается «каталитической конформацией».

Анализ изображений HS-AFM дикого типа HECT-домена E6AP выявил две конформации: одна выглядела сферической, другая — овальной. Используя симуляции AFM, овальные формы связали с L-конформацией, а сферические — либо с каталитической конформацией, либо с так называемой инвертированной T-конформацией, наблюдаемой у другого типа HECT-домена, где расстояние между остатками Cys составляет 16 Å.

Чтобы преодолеть ограничения пространственно-временного разрешения визуализации, эксперименты дополнили молекулярным моделированием для визуализации конформационных движений HECT-домена на атомарном уровне. С помощью симуляции AFM создали соответствующий псевдо-AFM фильм, который чётко показал изменение топографии от сферической к овальной форме.

«Хотя экспериментальные ограничения не позволяют нам разрешить промежуточные конформации, — объясняют исследователи, — проведённое моделирование предоставляет доказательства, что переходы между сферической и овальной формами HECT-домена, наблюдаемые с помощью HS-AFM, соответствуют функциональным конформационным движениям, при которых C-доля вращается относительно N-доли, тем самым позволяя изменяться между каталитической и L-образной конформациями HECT».

Дальнейшие эксперименты с мутантными HECT-доменами, обладающими меньшей гибкостью в шарнире, не выявили переключения между конформациями — мутантные домены были зафиксированы в каталитической конформации. Также обнаружили, что эти мутантные HECT-домены могут формировать два соединённых убиквитина более эффективно, чем дикий тип.

E6AP, лигаза типа HECT в этом исследовании, взаимодействует с белком E6, полученным из вируса папилломы человека (HPV), и убиквитинирует p53 — белок-супрессор опухолей. Также известно, что убиквитинирование p53 с помощью E6AP и E6 является основной причиной рака шейки матки. Однако механизм убиквитинирования p53 при взаимодействии белков E6AP и E6 остаётся неясным. В будущем команда планирует изучить структурную динамику комплексов E6AP/E6 и E6AP/E6/p53 с помощью HS-AFM и выяснить, как E6 повышает активность убиквитинирования p53 с помощью E6AP.