Новый метод позволяет метить белки в живых клетках без нарушения их функции

Исследователи из Университета Пенсильвании разработали мощный инструмент для изучения работы белков внутри живых клеток. Техника позволяет быстро, точно и с минимальным вмешательством встраивать аминокислоты и химические метки в белки живых клеток млекопитающих.

Изучение белков в их естественной клеточной среде критически важно для понимания биологических функций. Широко используются генетически кодируемые метки, такие как флуоресцентные белки и эпитопные последовательности.

Крупные метки могут изменять локализацию белка или нарушать его естественные взаимодействия. Малые молекулярные метки меньше влияют на структуру, но их сложно применять в живых клетках. Антитела часто несовместимы с экспериментами на живых клетках из-за своего размера и специфичности.

Большинство существующих методов не обладают временной точностью и не позволяют отслеживать активность белка в масштабах времени, значимых для клеточной сигнализации и адаптации. Технология, обеспечивающая точное, минимально инвазивное и быстрое мечение белков в условиях их естественной экспрессии, оставалась нереализованной.

В исследовании "Внутриклеточное редактирование белков позволяет включать неканонические остатки в эндогенные белки", опубликованном в Science, представлен метод редактирования белковых последовательностей внутри живых клеток млекопитающих для сайт-специфичного включения химически модифицированных аминокислот, эпитопных меток или других пептидных сегментов в эндогенные или экзогенно экспрессируемые белки с временным контролем.

Исследователи создали механизм редактирования белков с помощью двух сконструированных молекулярных инструментов, которые действуют как программируемые переключатели сплайсинга. Когда донорный белок попадает в клетку, эти инструменты активируются и точно встраивают выбранный белковый сегмент в определённую позицию внутри целевого белка.

Встроенные сегменты соединяются бесшовно, а молекулярная машинерия, обеспечившая вставку, удаляется. Редактирование может либо добавлять новые функции, либо восстанавливать исходные, в зависимости от конфигурации системы.

Редактирование белков было впервые продемонстрировано на модельных белках, включая кальнексин и β-актин. Успешная вставка новых аминокислотных последовательностей в эти белки была подтверждена с помощью иммуноблоттинга, микроскопии и масс-спектрометрии. Редактирование происходило в течение 10 минут после доставки донорного белка в клетку, что обеспечивает скорость, недостижимую для большинства других методов мечения.

В дальнейших тестах метод был применён к белкам с важными клеточными функциями, включая транскрипционный фактор c-Myc и киназу Chk1. Специфичные белковые сегменты временно заменялись на идентифицируемые метки, а затем восстанавливались до исходных последовательностей. После редактирования оба белка сохраняли нормальную активность, что было показано по фосфорилированию и сохранению ДНК-связывающих взаимодействий.

Исследователи также продемонстрировали, что отредактированные белки могут нести малые молекулы, такие как флуорофоры или биотин, путём модификации донорного белка для включения синтетической аминокислоты с химической "ручкой".

После мечения in vitro модифицированные белки доставлялись в клетки млекопитающих и встраивались в такие мишени, как β-актин или эндогенный кальнексин. Меченые белки сохраняли правильную клеточную локализацию и могли отслеживаться с помощью конфокальной микроскопии или выделяться с помощью аффинной очистки.

Липидные наночастицы были протестированы как альтернатива электроporation для доставки белков. Редактирование было успешным при использовании обоих методов, хотя липидные наночастицы оказались особенно эффективны, когда донорные белки были сконструированы с отрицательно заряженным "хвостом" для облегчения доставки.

Флуоресцентные сигналы от отредактированных белков сохранялись в течение часов и соответствовали ожидаемой локализации целевого белка внутри клетки. Например, кальнексин локализован в эндоплазматическом ретикулуме, а β-актин собирается в цитоскелете. Сигналы от неотредактированных или неправильно доставленных белков быстро исчезали, что указывает на минимальный фоновый шум. Сплайсинг происходил в течение минут, обеспечивая доступ к популяциям белков в биологически значимых временных масштабах.

Потенциальные применения техники охватывают молекулярную клеточную биологию и имеют значение для исследований болезней, разработки лекарств и биотехнологии.