Повышение точности генного редактирования: аутофагия смещает репарацию ДНК в сторону гомологичной рекомбинации
Южнокорейская исследовательская группа первой в мире значительно повысила низкую эффективность ключевого механизма редактирования генома — гомологичной рекомбинации (HR) — путем индукции аутофагии, естественного процесса в клетках.
Команда доктора Хе Джин Нам из Корейского исследовательского института химических технологий (KRICT) совместно с профессорами Донг Хён Джо и Сангсу Бэ из Медицинского колледжа Сеульского национального университета обнаружила, что индукция аутофагии с помощью депривации питательных веществ или ингибирования mTOR значительно повышает эффективность CRISPR–Cas9 редактирования на основе HR — до трех раз.
Метод также успешно подтвердил свою эффективность в клетках, полученных от пациентов с генетическими мутациями, и в живых животных моделях.
CRISPR–Cas9 создает двунитевые разрывы (DSBs) в ДНК для редактирования генов. Однако большинство этих разрывов восстанавливаются через подверженную ошибкам негомологичное соединение концов (NHEJ), что часто приводит к нежелательным мутациям.
Гомологичная рекомбинация (HR) — более точная форма репарации ДНК, но она происходит редко. Предыдущие попытки повысить активность HR были ограничены токсичностью и плохой совместимостью.
Исследователи предположили, что аутофагия может способствовать использованию HR. Когда аутофагию запускали (голоданием или ингибиторами mTOR), эффективность редактирования на основе HR увеличивалась в 1.4–3.1 раза для различных генов-мишеней и размеров вставок ДНК. Клетки, неспособные к аутофагии, такого улучшения не показали.
Даже альтернативные версии CRISPR, такие как никаза Cas9 (nCas9) и «неактивная» Cas9 (dCas9), показали улучшенную эффективность редактирования в условиях аутофагии, что говорит о широкой применимости стратегии.
Анализ показал, что аутофагия усиливает накопление белков репарации ДНК, связанных с HR, в комплексе Cas9, что может направлять репарацию к более точным результатам.
В экспериментах с клетками пациентов, несущими мутации в гене MPZL2 (связаны с потерей слуха), метод привел к увеличению экспрессии скорректированного гена до трех раз.
В моделях на мышах, при редактировании гена в сетчатке, индукция аутофагии привела к примерно трехкратному улучшению эффективности редактирования.
Это первое исследование, демонстрирующее, что аутофагия может повышать точность редактирования генома как в клетках человека, так и в животных моделях.
Доктор Нам заявил: «Использование аутофагии для усиления гомологичной рекомбинации представляет собой прорывную стратегию преодоления ключевых ограничений современных технологий редактирования генов».
Президент KRICT Янг-Кук Ли добавил: «Это достижение значительно улучшает как эффективность, так и безопасность редактирования генома и знаменует важную веху в развитии прецизионной терапии».