Протокол для высокоразрешающей визуализации живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии
Исследователи из Университета Канадзавы под руководством Такеси Фукумы и Такехико Итикавы разработали и представили полный протокол использования атомно-силовой микроскопии (АСМ) для получения изображений внутри живых клеток. Работа опубликована в журнале STAR Protocols.
АСМ, разработанная в 1980-х годах, использует изменение сил между поверхностью образца и наноразмерным острием на кантилевере для создания изображений топографии с наноразрешением. Однако до сих пор метод был ограничен исследованием поверхностей.
Существующие методы визуализации внутренней структуры клеток имеют недостатки:
- Электронная микроскопия обеспечивает наноразрешение, но несовместима с живыми клетками.
- Флуоресцентная микроскопия применима к живым клеткам, но достижение наноразрешения сопряжено с практическими сложностями.
АСМ лишена этих ограничений. Модификация прибора наноиглой для проникновения в клетки позволила исследователям продемонстрировать возможность визуализации изнутри клеток с наноразрешением. Метод назван наноэндоскопия-АСМ.
Этапы протокола наноэндоскопии-АСМ
- Подготовка клеток: окрашивание флуоресцентным красителем для быстрой идентификации области сканирования.
- Изготовление наноигл: двумя способами — травление структуры сфокусированным ионным пучком или наращивание с помощью электронно-лучевого осаждения.
- Проведение наноэндоскопии: описан подход для 2D и 3D визуализации, а также процедура очистки после получения изображений.
- Обработка данных: для визуализации измеренных данных.
Протокол содержит практические рекомендации для каждого этапа и руководство по устранению неполадок.
Метод подходит для наблюдения интактных внутриклеточных структур: митохондрий, фокальных адгезий, эндоплазматического ретикулума, лизосом, аппарата Гольджи, межорганелльных соединений и структур, разделённых по типу жидкость-жидкость.
Исследователи заключают: «Этот протокол может стать стандартным инструментом для изучения наноразмерных структур».