Новый подход CLEM использует наночастицы золота как единый зонд

Корреляционная световая и электронная микроскопия (CLEM) — мощный инструмент в биоимиджинге, сочетающий преимущества световой микроскопии (LM) для визуализации живых клеток с молекулярной специфичностью и электронной микроскопии (EM) для получения высокого пространственного разрешения и ультраструктурной информации. Однако существующие зонды для маркировки целевых биомолекул имеют недостатки, включая нестабильность при LM (фотовыцветание).

В новой статье, опубликованной в Light Science & Application, группа учёных под руководством профессора Паолы Борри из Кардиффского университета и профессора Пола Веркаде из Бристольского университета (Великобритания) разработала новый подход CLEM. В нём используются маленькие наночастицы золота в качестве единого зонда, видимого как в LM, так и в EM с высоким контрастом и фотостабильностью, без необходимости применения флуоресцентных зондов.

Для LM учёные использовали оптический микроскоп, разработанный в группе профессора Борри. Этот микроскоп детектирует нелинейный оптический отклик наночастиц золота — четырёхволновое смешение (FWM). С помощью этого метода исследователи смогли детектировать индивидуальные наночастицы золота (радиусом до 5 нм) в качестве единых зондов для белка эпидермального фактора роста в раковых клетках человека. Частицы были локализованы с нанометрической точностью и без фона с помощью световой микроскопии, а затем точно соотнесены с изображением просвечивающего электронного микроскопа.

Принцип работы метода FWM-CLEM:

• В основе метода FWM лежит нелинейное взаимодействие света третьего порядка, при котором три световых поля взаимодействуют в среде, генерируя четвёртую волну.
• В данной схеме все световые волны имеют одну центральную частоту, резонирующую с пиком оптического поглощения наночастицы золота.
• Для возбуждения и детекции используется комбинация коротких (~150 фс) оптических импульсов (насосный и пробный), генерируемых одним лазерным источником.
• Детектируемый сигнал FWM можно рассматривать как изменение способности наночастицы золота пропускать и рассеивать свет, индуцированное насосным импульсом.

Благодаря безфоновому и фотостабильному отклику FWM от индивидуальных наночастиц золота, которые также хорошо видны в EM из-за их электронно-плотного состава, метод FWM-CLEM открывает новые возможности для высокоточных корреляционных исследований. Он устраняет необходимость в нестабильных флуорофорах или дополнительных фидуциальных маркерах, что значительно упрощает подготовку образцов.

Исследователи заключают, что FWM-CLEM открывает новые захватывающие перспективы. Например, в сочетании с существующими стратегиями маркировки или инкапсуляции наночастиц золота в вирионы, метод FWM позволяет отслеживать отдельные вирионы в течение длительного времени, без фона и глубоко внутри живых клеток и тканей, а затем точно определять ключевые события (например, высвобождение генома) в контексте клеточной ультраструктуры с помощью CLEM.