Новый метод упрощает количественный анализ строительных блоков ДНК

Высокочувствительная и простая в использовании методика, применимая к образцам тканей, может быть полезна, например, исследователям, специализирующимся на митохондриальных заболеваниях и раке.

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) несет генетическую информацию в хромосомах ядер клеток и в митохондриях. При репликации или репарации ДНК ферменты ДНК-полимеразы синтезируют новую цепь, используя в качестве строительных блоков дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ).

Ранее измерение концентрации дНТФ было сложной задачей, особенно для образцов с низким уровнем синтеза ДНК и, следовательно, низкой концентрацией дНТФ. Исследователи разработали методику, которая позволяет измерять концентрации дНТФ с гораздо более высокой чувствительностью, например, в небольших образцах тканей мышей.

Исследование опубликовано в Nucleic Acids Research.

Чувствительный метод для изучения митохондриальных заболеваний

В быстро делящихся клетках, например, в костном мозге и раковой ткани, концентрации дНТФ высоки, а в медленно или совсем не делящихся клетках, таких как клетки печени и мышц, концентрации очень низки. Однако всем клеткам необходимы дНТФ для репарации повреждений ДНК и поддержания митохондриальной ДНК.

У пациентов с митохондриальным заболеванием — синдромом GRACILE — и в его мышиной модели основные симптомы проявляются в печени и почках. В этих тканях мало делящихся клеток и, следовательно, низкая концентрация дНТФ.

Новая надежная и чувствительная методика

В новом анализе дНТФ значительными инновациями стали использование ДНК-полимеразы, устойчивой к примесям в образце, а также применение чувствительного флуоресцентного красителя, отличающего двуцепочечную ДНК от одноцепочечной.

Одной из технических проблем было потенциальное влияние рибонуклеотидов — строительных блоков РНК, которые в тканях могут быть в тысячи раз более обильными, чем дНТФ. Разрабатывая методику, Янне Пурхонен обнаружил, что добавление другого фермента, разрезающего цепь ДНК в месте ошибочно включенного рибонуклеотида, позволяет дифференцировать правильные и ложные продукты реакции на основе их температуры плавления. Таким образом, сигнал от ошибочно включенных рибонуклеотидов можно было устранить.

Исследование было проведено группой GRACILE под руководством доцента Юкки Каллиъярви и профессора эмериты Винеты Феллман в Исследовательском центре Folkhälsan.

«Мы надеемся, что этот анализ окажется полезным для исследователей митохондриальных заболеваний, а также в других областях биологических и медицинских исследований», — говорит Каллиъярви.