ПЦР-тесты, активируемые светом

Новый подход химиков из LMU может значительно улучшить диагностические тесты на основе ПЦР. Используемые ферменты активируются световыми импульсами.

ДНК-полимеразы и другие ферменты, модифицирующие ДНК, — важнейшие инструменты в биотехнологии и диагностике. Они являются ключевым компонентом для диагностики COVID-19 методом ПЦР. Однако эти ферменты часто имеют существенные недостатки: некоторые проявляют значительную активность уже на этапе подготовки образцов, другие — обладают нежелательными побочными активностями. И то, и другое может привести к потере специфичности и чувствительности теста, чего в диагностике необходимо избегать.

Решение для ПЦР-тестов (например, на COVID-19) — создание "горячего старта" (hot-start), когда фермент неактивен до достижения высокой температуры активации. Главный недостаток этого подхода в том, что он неприменим для ферментов, повреждаемых нагреванием, отмечает биохимик LMU Андрес Вера. Кроме того, разработка фермента с "горячим стартом" трудоёмка, и этот процесс необходимо повторять для каждого нового фермента.

Вместе с Мерв-Зейнеп Кесичи из группы профессора Филиппа Тиннефельда на химическом факультете LMU, Андрес нашёл обходной путь, создав ферменты со "световым стартом" (light-start). Эти ферменты заблокированы до тех пор, пока импульс УФ-света не реактивирует их.

"Ферменты, контролируемые светом, существуют уже давно, но уникальность нашего подхода в том, что его можно применить практически к любому ферменту, обрабатывающему ДНК. Раньше всегда требовалась очень подробная информация о механизме работы фермента, и не было гарантии, что удастся найти способ его блокировки и световой активации", — говорит руководитель проекта Вера.

В их подходе исследователи присоединяют к ферменту фрагмент ДНК, который вытесняет любые другие субстраты, делая фермент полностью неактивным (включая побочные активности). Световой импульс используется для разрезания ДНК, прикреплённой к ферменту, что приводит к получению фермента со 100% активностью. Главное преимущество — этот механизм должен работать для широкого спектра ДНК-связывающих ферментов независимо от их конкретного способа действия.

В доказательство исследователи создали четыре светоактивируемые версии разных ферментов для обработки ДНК. Среди них была ДНК-полимераза Phi29, широко используемая для амплификации целых геномов, но слишком чувствительная к нагреванию для адаптации к методам "горячего старта". Кроме того, команда продемонстрировала ПЦР со "световым стартом" и доказала, что их ДНК-полимеразы не уступают или превосходят коммерческие ферменты с "горячим стартом" для ПЦР.

Филипп Тиннефельд оптимистично оценивает эту разработку: "Это определённо поможет создавать лучшие ферменты для биотехнологии и диагностики. Кроме того, современные машины для ПЦР в реальном времени уже оснащены источниками света, и их можно легко модифицировать, чтобы вывести эти ферменты на рынок в ближайшее время".

Исследование опубликовано в Nucleic Acids Research.