Стехиометрия факторов OSKM определяет эффективность репрограммирования в iPS-клетки

Исследователи из Центра iPS-клеток Университета Киото обнаружили простой способ повысить выход индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS-клеток). Основным препятствием в науке о репрограммировании является получение достаточного количества iPS-клеток для экспериментов. Отчёт, опубликованный в Stem Cell Reports, показывает, что простое добавление 9 аминокислот к трансгену Klf4 резко увеличивает производство полностью репрограммированных мышиных iPS-клеток.

Факторы Яманаки Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc (OSKM) обычно доставляются с помощью единых полицистронных векторов, где гены связаны, но производят четыре отдельных белка. Однако тонкие вариации векторов могут влиять на эффективность репрограммирования. В частности, длина Klf4 оказалась значимым фактором.

Два независимых исследования 1996 года предсказали разные старт-кодоны в последовательности Klf4, что при трансляции приводит к белкам, отличающимся на девять аминокислот в длину. «Некоторые лаборатории используют короткий Klf4 (Klf4S), некоторые — длинный (Klf4L)», — говорит Кнут Вольтжен, доцент CiRA.

Используя транспозоны piggyBac для доставки различных полицистронных факторов, команда Вольтжена обнаружила:

• Векторы с Klf4S приводили к большему числу клеток, инициировавших репрограммирование, но они оставались частично репрограммированными.
• Большинство клеток, трансфицированных векторами с Klf4L, становились настоящими iPS-клетками.

Полицистронные векторы с изоформой Klf4L показали гораздо более высокий уровень экспрессии белка Klf4. Это говорит о том, что стехиометрия (соотношение) факторов репрограммирования может быть ключевым фактором эффективности. «Стехиометрия так важна. Независимо от используемой системы, она сильно влияет на качество iPS-клеток», — отмечает Вольтжен.

Добавление недостающих девяти аминокислот к Klf4S изменило экспрессию Klf4 и динамику репрограммирования, сделав их аналогичными Klf4L.

Генные паттерны во время репрограммирования также различались в зависимости от изоформы Klf4. Изучив восемь разных полицистронных векторов, команда обнаружила, что как эффективность репрограммирования, так и экспрессия генов разветвляются в зависимости от изоформы Klf4.

Интересно, что зависимость от изоформы Klf4 проявлялась в основном при использовании полицистронных векторов. При доставке Klf4S или Klf4L с помощью монопистронного вектора в комбинации с полицистронным вектором OSM эта зависимость исчезала. Это указывает, что полицистронный дизайн вектора влияет на уровень экспрессии Klf4, в то время как функция самого белка может не меняться.

«Изначально мы не представляли, насколько большую разницу [эти 9 аминокислот] будут иметь. Это показывает, как важно действительно знать материалы, с которыми работаешь», — подчёркивает первый автор исследования Шин-Иль Ким.