Новый контрольный переключатель может упростить программирование РНК-терапий

Инженеры MIT разработали новый способ заставить клетки включать синтетический ген с помощью РНК-сенсора. Этот подход может позволить создавать целевые терапии для рака и других заболеваний, обеспечивая активацию синтетических генов только в специфических клетках.

Исследователи продемонстрировали, что их сенсор может точно идентифицировать клетки, экспрессирующие мутированную версию гена p53 (который способствует развитию рака), и включать ген, кодирующий флуоресцентный белок, только в этих клетках. В будущем они планируют разработать сенсоры, которые будут запускать производство убивающих клетки белков в раковых клетках, не затрагивая здоровые.

"Растет интерес к снижению побочных эффектов терапий", — говорит Джеймс Коллинз. — "С этой системой мы можем нацеливаться на очень специфичные больные клетки и ткани, что открывает возможность идентифицировать раковые клетки и затем доставлять высокоэффективные терапевтические средства".

Этот подход также можно использовать для разработки методов лечения других заболеваний, включая вирусные или бактериальные инфекции.

РНК-контрольный переключатель

Многие экспериментальные терапии, связанные с доставкой ДНК или РНК (например, генная терапия, CRISPR-терапии, РНК-интерференция), находятся в разработке. Важный аспект таких терапий — обеспечение их включения только в целевых клетках с помощью программируемого контрольного переключателя.

В 2021 году лаборатория Коллинза разработала контрольный переключатель для РНК-терапий под названием eToehold. Однако такие системы сложно проектировать, так как их функция зависит не только от последовательности молекулы, но и от её трёхмерной структуры.

В новом исследовании учёные хотели создать более легко программируемую систему. Вместо использования внутренних сайтов входа рибосомы (IRES) они решили использовать синтетическую цепь РНК (РНК-конструкт) в качестве целевой молекулы. Это позволило бы перепрограммировать конструкт для нацеливания на разные мРНК-молекулы, просто меняя его РНК-последовательность.

"С этой новой системой у нас есть очень простой, программируемый способ создания контрольных элементов, которые будут реагировать только в присутствии этих целевых последовательностей", — говорит Коллинз.

Для этого исследователи использовали фермент, естественно присутствующий в большинстве клеток животных, — аденозиндеаминазу, действующую на РНК (ADAR). Этот фермент редактирует основания в РНК-молекулах, превращая неспаренные основания аденозина в инозин.

ADAR может обнаруживать и исправлять несоответствия в двуцепочечной РНК. Исследователи спроектировали свой сенсорный РНК-конструкт так, чтобы он содержал последовательность, комплементарную целевой мРНК, но с одним несоответствием. Это привлекает внимание ADAR, который естественным образом присутствует в клетке и исправляет несоответствие.

Когда ADAR превращает аденозин в инозин в РНК-сенсоре, это редактирование удаляет стоп-кодон в последовательности. После удаления стоп-кодона клетка начинает считывать РНК-конструкт, который исследователи спроектировали так, чтобы он содержал два белок-кодирующих гена. Первый — для репортёрной молекулы (в данном случае флуоресцентного белка). В будущих версиях его можно заменить геном, кодирующим терапевтический агент.

Второй синтетический ген кодирует усечённую версию фермента ADAR. По мере производства большего количества ADAR фермент находит и активирует больше копий синтетического РНК-конструкта. Это создаёт петлю положительной обратной связи, усиливающую экспрессию гена флуоресцентного репортёра.

Другие исследователи показали, что ADAR можно использовать для такого рода РНК-таргетинга, но большинство этих исследований ограничивались клетками, естественно производящими большое количество фермента, например, нейронами.

"Нам требуется лишь очень небольшое количество ADAR, чтобы первоначально запустить сеть. А затем, благодаря конструкции с положительной обратной связью, этот небольшой триггер заставляет клетки экспрессировать высокие уровни компактной формы этого фермента, встроенной в конструкт", — объясняет Коллинз. — "Это расширяет потенциальные области применения системы, поскольку теперь она не ограничена клетками с высоким фоновым уровнем ADAR".

Высокая точность

В тестах на человеческих клетках исследователи проверили, может ли их сенсор, названный DART VADAR (detection and amplification of RNA triggers via ADAR), различать очень похожие мРНК-последовательности. Для этого они вставили сенсорный конструкт в человеческие клетки, имевшие либо нормальную версию гена p53, либо мутированную версию, которая отличается всего на одну пару оснований и, как известно, способствует развитию рака.

"Мы показываем, что для этих сенсоров можно добиться очень высокого разрешения и очень высокой точности", — говорит Рафаэль Гайе. — "С тщательно спроектированным сенсором можно получить разный уровень активации в зависимости от того, производят ли клетки РНК, включающую мутацию, или нет".

В другом эксперименте на мышиных клетках исследователи показали, что сенсорный конструкт может различать близкородственные типы клеток, дифференцирующиеся в костные или мышечные клетки.

Поскольку исследователи использовали усечённую версию фермента ADAR (около 1600 пар оснований), весь конструкт легко помещается в вектор AAV — тип модифицированного безвредного вируса, который часто используется в клинике для доставки генетического материала людям.

Исследователи теперь планируют протестировать свою систему на животных моделях рака, чтобы проверить, могут ли они доставлять синтетические конструкты, которые будут избирательно убивать опухолевые клетки, производя летальные соединения только внутри этих клеток.