Связь фенотипов с генотипами: Новая стратегия редактирования генов
Технология CRISPR-Cas9 позволила ученым редактировать гены с высокой точностью и гибкостью, подобно работе в текстовом редакторе. Однако у метода есть существенный недостаток: после разрезания ДНК система восстановления клетки (nonhomologous end-joining, NHEJ) часто вносит ошибки — замены, делеции или вставки. Эффективность CRISPR также варьируется: иногда инактивируются обе копии гена, иногда только одна. Эти непредсказуемые изменения ДНК затрудняют интерпретацию связи между наблюдаемым фенотипом (изменением клетки) и его генетической причиной.
В новой публикации в Cell Reports лаборатория Танигучи из Института нейронаук Макса Планка во Флориде (MPFI) представила методологию, позволяющую напрямую связать фенотип с генотипом. Стратегия сочетает лазерную микродиссекцию с генотипированием отдельных клеток.
"Хотя CRISPR точно нацеливается на нужный ген, из-за NHEJ его эффекты могут быть очень вариабельны, — объясняет Андре Штайнеке, первый автор публикации. — CRISPR может полностью инактивировать гены, ослабить их функцию или даже усилить. Наша цель — создать широко применимую стратегию, способную надежно определить точную генетическую причину и соотнести ее с наблюдаемым фенотипом".
Для валидации метода команда использовала CRISPR для нацеливания на ген Ankyrin-G (AnkG) в пирамидальных нейронах. Белок AnkG локализуется в аксонном инициальном сегменте (AIS). При его удалении AIS заметно утолщается. Большинство нейронов с CRISPR демонстрировали потерю AnkG и утолщенный AIS, но небольшая часть сохраняла нормальные уровни белка и толщину AIS, что подтвердило вариабельность эффектов CRISPR.
Затем с помощью лазерной микродиссекции ученые изолировали отдельные нейроны с известным фенотипом и провели их секвенирование. Стратегия надежно связала фенотип с генотипом: нейроны без AnkG имели loss-of-function мутации в обеих копиях гена, а нейроны с нормальным AnkG — мутации только в одной копии (при трансфекции CRISPR) или нормальный генотип (контроль). Метод также подтвердили на двух других генах — MeCP2 и Satb2.
"Идеальное соответствие между генотипами, определенными нашим секвенированием отдельных клеток, и генотипами, выведенными из оценки фенотипа, говорит о том, что наш подход — мощный новый метод, способный повысить надежность и расширить применение CRISPR-технологий", — отмечает Хироки Танигучи.