Метод pMINFLUX преодолевает дифракционный предел для одновременного отслеживания молекул
Исследователи из Мюнхенского университета имени Людвига и Максимилиана (LMU) разработали инновационный метод для одновременного отслеживания быстрых динамических процессов нескольких молекул в наномасштабе.
Биологические процессы в организме происходят при взаимодействии биомолекул, таких как белки и ДНК, на масштабе в несколько нанометров. Это делает их недоступными для наблюдения с помощью флуоресцентной микроскопии, которая имеет дифракционный предел разрешения около 200 нанометров.
Если два флуоресцентных красителя, маркирующих биомолекулы, находятся ближе этого оптического предела, их свечение невозможно различить под микроскопом, что делает невозможным точное определение их позиций.
В классических методах микроскопии сверхвысокого разрешения этот предел преодолевают, заставляя красители «мигать» — включать и выключать флуоресценцию. Это позволяет временно разделить их сигналы и локализовать их с точностью ниже классического предела.
Однако для изучения быстрых динамических процессов у этого подхода есть серьёзный недостаток: мигание не позволяет одновременно локализовать несколько красителей, что значительно снижает временное разрешение при исследовании динамики взаимодействий нескольких молекул.
Под руководством профессора химии LMU Филипа Тиннефельда и в сотрудничестве с профессором Фернандо Стефани (Буэнос-Айрес) исследователи разработали метод pMINFLUX multiplexing для решения этой проблемы. Работа опубликована в журнале Nature Photonics.
MINFLUX — это метод микроскопии сверхвысокого разрешения, позволяющий проводить локализацию с точностью до одного нанометра. В отличие от обычного MINFLUX, pMINFLUX регистрирует разницу во времени между возбуждением красителей лазерным импульсом и последующей флуоресценцией с разрешением менее наносекунды.
Помимо локализации, это даёт информацию о другом фундаментальном свойстве флуоресценции — времени жизни флуоресценции. Это среднее время, за которое молекула красителя флуоресцирует после возбуждения.
«Время жизни флуоресценции зависит от используемого красителя, — объясняет Фиона Коул, соавтор публикации. — Мы использовали различия во времени жизни флуоресценции разных красителей, чтобы присвоить флуоресцентные фотоны испустившему их красителю, без необходимости мигания и временного разделения».
Для этого исследователи адаптировали алгоритм локализации, включив в него мультиэкспоненциальную модель подгонки для достижения необходимого разделения сигналов.
«Это позволило нам одновременно определять положение нескольких красителей и исследовать быстрые динамические процессы между несколькими молекулами с нанометровой точностью», — добавляет Йонас Церингер, также соавтор работы.
Учёные продемонстрировали свой метод, точно отследив, как две цепи ДНК перескакивают между разными позициями на наноструктуре ДНК-оригами, а также разделив поступательное и вращательное движение наноструктуры ДНК-оригами и измерив расстояние между антиген-связывающими участками антител.
«Но это только начало, — говорит Филип Тиннефельд. — Я уверен, что pMINFLUX multiplexing с его высоким временным и пространственным разрешением в будущем даст новые знания о взаимодействиях белков и других биологических явлениях».